检索历史 清除

摘要背景及目的：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界范围内高发病率、高死亡率的恶性肿瘤之一。手术部分肝切除、肝移植及放化疗是HCC最主要的治疗方案。近年来，影像引导消融、分子靶向治疗、免疫治疗等多种方法也取得了长足进步，但HCC患者的总体生存率并无明显升高，5年生存率低于20%。HCC的发生、发展的分子机制目前仍不清楚，仍缺乏判断HCC病情进展及判断预后的分子标志物。<br>　　Rab是一个小分子GTPases家族，在囊泡运输、蛋白转运、膜靶向融合等起主要调节调节作用。近年来，有研究发现部分Rab蛋白在肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及肿瘤抗药性上起关键作用，可作为许多肿瘤判断预后的重要指标。越来越的研究证实RabGTPases参与了HCC的发生发展。作为Rab家族成员的Rab40b与肿瘤的相关性目前研究较少。有研究显示Rab40b与胃癌的增殖、侵袭、转移及高病理分级相关，高Rab40b表达的患者预后更差。另有研究发现，在乳腺癌细胞中Rab40b能促使乳腺癌细胞侵袭性伪足成熟，并能促使含MMP2/9的囊泡细胞外释放破坏基底膜，促进肿瘤细胞转移。Rab40b在肝癌组织中的表达情况目前尚不清楚，且其与肝癌发生、发展有无相关性及作用机制需一步探讨。<br>　　方法：<br>　　1.Oncomine等数据库挖掘分析HCC和正常肝脏中Rab40bmRNA水平有无差异。<br>　　2.Rab40b蛋白在HCC组织表达及与患者临床、病理指标的相关性<br>　　1)采用免疫组织化学方法分析90例肝癌组织及相应癌旁正常肝组织中Rab40b蛋白的表达情况。<br>　　2)采用Spearman,s相关性分析Rab40b与Ki67、AFP及临床指标的相关性；通过Kaplan-Meier生存分析法分析Rab40b蛋白与HCC患者预后的关系。<br>　　3.Rab40b对HCC细胞株增殖、侵袭、迁移的影响<br>　　1)westernbolt检测正常肝细胞株MIHA及肝癌细胞株(SMMc-7721、Huh7、HepG2、SK-Hep1和Hep3B)Rab40b蛋白的表达<br>　　2)慢病毒干扰Rab40b表达的SMMc-7721和慢病毒过表达Rab40b的Huh7细胞，分别用CCK-8、伤口愈合试验和transwell试验用于评估细胞增殖、迁移和侵袭。<br>　　3)BALB/c小鼠原位皮下成瘤实验，验证Rab40b对肿瘤增殖等的影响。<br>　　4.Rab40b促进HCC进展的机制探讨<br>　　1)采用流式细胞术分析Rab40b对细胞周期和凋亡的影响。<br>　　2)KEEG信号通路分析Rab40b对HCC信号通路的影响<br>　　3)采用Westernbolt及免疫组化检测Rab40b对信号通路相关蛋白调控。<br>　　结果：<br>　　1.Oncomine数据显示Rab40bmRNA在HCC组织较正常肝组织显著升高(p＜0.001)，TheHumanProteinAtlas数据库分析显示高Rab40bmRNA表达水平的HCC患者短期预后更差。<br>　　2.Rab40b在HCC组织表达及与患者临床指标的相关性分析<br>　　1)免疫组织化学染色显示Rab40b蛋白在肝癌细胞核呈显著高于癌旁核(5.81+4.91vs0.63+1.69，p＜0.001)，但在胞浆中的表达无差异(9.32+3.45vs9.61+2.38,P=0.506)。<br>　　2)Rab40b蛋白在肝癌组织中的表达与Ki67(r=0.394,p＜0.001)、高病理分级(r=0.285,p＜0.05)显著相关。<br>　　3)生存期分析结果表明Rab40b蛋白水平高的HCC患者预后显著更差(24.6%vs53.1%，p＜0.05)；COX多因素回归分析证明Rab40b是HCC患者独立的预后因子(p＜0.05)。<br>　　3.Rab40b对HCC细胞株增殖、侵袭、迁移的影响<br>　　1)Rab40b在SMMc-7721细胞株中呈显著高表达，在Huh7细胞株低表达。<br>　　2)干扰Rab40b的表达能显著抑制SMMc-7721细胞株的增殖、迁移和侵袭，也能抑制裸鼠皮下瘤的大小(p＜0.05)。<br>　　4.Rab40b促进HCC进展的分子学机制<br>　　1)FCM显示抑制Rab40b表达能诱导肝癌细胞株G0/G1期停滞和细胞凋亡增加。<br>　　2)westernbolt分析显示：敲低Rab40b能引起周期蛋白cyclinD1、cyclinE1的表达下降，P21和cleaved-caspase-3的表达增加。<br>　　3)免疫组化染色显示：与空载组相比，过表达Rab40b组裸鼠原位瘤cyclinD1和cyclinE1表达上调。<br>　　4)KEGG通路分析显示Rab40b通过调控PI3K/AKT信号通路影响细胞周期和细胞存活。<br>　　5)Westernbolt显示干扰Rab40b能引起p-PI3K、p-AKT表达下调。<br>　　结论：Rab40b蛋白在肝癌组织表达显著上调，并与Ki67、高病理分级正相关，与患者预后负相关；Rab40b蛋白是HCC预后的独立预测因子。Rab40b通过激活PI3K/AKT信号通路促进HCC进展。