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摘要1.昆虫保幼激素膜上介导受体的筛选<br>　　保幼激素(juvenile hormone，JH)是一种倍半萜类激素，由位于昆虫脑后的咽侧体合成并分泌，主要调控昆虫蜕皮变态和生殖等。JH发挥功能依赖于其核受体Met(Methoprene-tolerant)介导的基因组转录途径和细胞膜依赖的非基因组信号转导通路。JH核基因组转录途径中，JH结合核受体Met并与Taiman(Tai)形成转录复合体调控下游基因转录，如：Cdc、Mcm、Kr-h1、Ago等，继而调控飞蝗(Locusta migratoria)卵黄发生。其中Kr-h1是JH通路早期响应基因，能够响应JH诱导并介导L.migratoria卵黄原蛋白(Vitellogenin，Vg)合成。近年研究表明，JH能够通过G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)和受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase, RTKs)触发非基因组信号转导通路，与核基因组转录途径协同调控JH响应基因转录，但是相关研究并不深入。据此，本论文以JH依赖性飞蝗卵黄发生为研究对象，虫体RNAi沉默GPCR和RTK后分析JH核基因组转录途径介导的下游Kr-h1、VgA、VgB基因转录以及JH触发的胞内第二信使系统，以期筛选出介导JH非基因组信号转导通路的膜上受体。<br>　　运用RNAi、qRT-PCR方法，虫体沉默25个GPCR基因，2个RTK基因能够显著抑制JH上调表达的Kr-h1、VgA和VgB基因。这些基因包括：GPCRclassA成员：NYR-1、adrenergicreceptor-1、CCKR-1、oxytocin-1、oxytocin-2、NTSR-1、5-HTR-1、5-HTR-2、5-HTR-3和5-HTR-4；classB成员：PTHR-1、PTHR-2、PTHR-3、PTHR-4、Methuselah-like-1、Methuselah-like-2、Methuselah-like-3、Methuselah-like-4、Methuselah-like-5和ADHR-1；classD成员：pHregulator-1；classF成员：Frizzled-1、Frizzled-2、Frizzled-3；RTK家族成员：FGFR-like-1和FGFR-like-2。并对其功能进行了分类，推测FGFR-like-1和FGFR-like-2可能参与了Akt通路；adrenergicreceptor-1，CCKR-1，5-HTR-1，5-HTR-2，5-HTR-3，5-HTR-4，PTHR-1，PTHR-2，PTHR-3，PTHR-4和ADHR-1可能参与cAMP-PKA信号通路；oxytocin-1，oxytocin-2，NYR-1和NTSR-1可能参与DAG-PKC通路。而Frizzled-1，Frizzled-2，Frizzled-3属于膜受体Fz，直接参与Wnt-β-caterin信号通路。其他基因类型与功能尚不明确。通过ELISA测定JH诱导胞内cAMP浓度结果显示，dsRNA注射沉默FGFR-like-1和FGFR-like-2能够显著抑制JH上调的胞内cAMP浓度，说明FGFR-like-1和FGFR-like-2能够介导JH触发的胞内cAMP第二信使通路。再以cAMP变化量为标准，用ELISA筛选出两个基因。<br>　　本论文研究结果初步筛选出能够介导JH信号通路的25个GPCR基因和2个RTK基因，可以为进一步开展JH非基因组信号通路研究奠定基础，丰富JH信号通路调控昆虫生殖的研究进展。<br>　　2.核型多角体病毒膜受体的筛选<br>　　核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV)属于杆状病毒，是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒，在自然界中以节肢动物作为专一性宿主进行感染和传播。杆状病毒不仅可以因为其特异性和对人体无害性而作为杀虫剂被广泛应用，在真核表达系统、基因治疗、以及基因工程疫苗等方面也都有重要的实际应用。NPV具有双相复制周期，会产生两种具有不同形态和不同功能的病毒粒子，即包涵体来源型病毒(Occlusion derived virus，ODV)和出芽型病毒(Budded virus，BV)。ODV包涵于多角体中，负责宿主个体之间的感染过程；BV由ODV产生，负责宿主体内各组织间的感染过程。感染过程从多角体进入宿主体内开始，多角体在宿主中肠碱性环境中释放ODV，ODV进入宿主上皮细胞，在细胞核进行病毒的转录和翻译，新生的BV粒子从基底膜出芽引起全身感染。在继发感染过程中，BV粒子的囊膜蛋白起到了至关重要的作用，由BV囊膜蛋白结合宿主细胞表面膜受体从而进入宿主细胞。这个囊膜蛋白在组Ⅰ核型多角体病毒中是GP64，而在组Ⅱ中是F蛋白。目前对于BV如何进入宿主细胞内一直存有疑问，与BV囊膜蛋白结合的膜受体也一直不明。C型凝集素是一类钙依赖性糖结合蛋白，其功能是作为模式识别受体识别非己成分，调节细胞的吞噬作用和粘连反应，增强细胞黑化作用和包囊作用，抑制或加速病毒在体内的增殖。在本实验组前期的工作中表明BV能够诱导棉铃虫C型凝集素(Helicoverpa armigera Lectin，Ha-lectin)的表达BV囊膜融合蛋白F(NPVF)与分泌性C型凝集素存在相互作用，我们推断棉铃虫细胞膜上可能存在特异的受体蛋白，能够与C型凝集素互作，通过招募C型凝集素，递呈BV到细胞表面受体，增强或抑制病毒粒子的内吞。综上所述，本论文通过棉柃虫(Helicoverpa&nbsp;armigera)为研究对象，围绕BV囊膜蛋白与C型凝集素与宿主细胞膜受体三者之间的关系展开对核型多角体病毒膜受体的筛选工作。<br>　　本论文使用的棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus, HaNPV)属于组Ⅱ。本论文在本实验室早期对Ha-lectin与NPVF关系的研究的基础上，对其质谱结果进行了初期筛选，筛选出了疑似膜受体VHDLR。之后利用免疫荧光、Co-IP、Westernblot、RNAi等细胞生物学、分子生物学和遗传学的方法，对VHDLR进行鉴定和分析。确定了VHDLR是与BV囊膜蛋白NPVF结合的宿主细胞表面膜受体。推测三者之间的作用机制为Ha-lectin在血淋巴组织中捕获BV病毒粒子，将其呈递到宿主细胞膜表面，使BV囊膜蛋白NPVF与宿主细胞膜受体VHDLR结合，从而使BV病粒子进入宿主细胞内。并且通过制备VHDLR各组分的表达载体，在H-O细胞系内验证了VHDLR各组分与Ha-lectin、NPVF的关系。确定NPVF是与VHDLR内的CDomain结合，Ha-lectin不与VHDLR结合。对于揭示杆状病毒进入宿主细胞的机制是全新的研究，也为接下来筛选组Ⅰ的GP64的膜受体的研究奠定了基础。