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摘要寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是通过蚊虫传播的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科的黄病毒属。寨卡病毒与黄热病毒(YFV)、登革热病毒(DENV)、日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗病毒(WNV)特征相似，在人类中引起轻度乃至严重危害生命的感染。在2007年首次爆发寨卡病毒后，它已成为严重神经并发症的一种重要的人类病理基因，它会造成成人吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)和各种胎儿异常，如小头畸形，引起了人们的普遍关注。目前，全球还尚无针对性的疫苗和药物，寨卡病毒造成的危害已经成了全球公共卫生问题。<br>　　为了探求新的抑制寨卡病毒的方法，我们运用一种靶向切割RNA病毒的工具CRISPR-Cas13系统抑制寨卡病毒的复制。CRISPR-Cas13系统(以前被成为C2c2)是CRISPR-Cas系统中的第二大类第VI型。该系统类似于CRISPR-Cas9系统，但与靶向DNA的Cas9不同，它是基于细菌免疫系统的RNA靶向编辑系统。CRISPR-Cas13是目前家族中发现的专一靶向RNA的系统，它包含单一的效应蛋白Cas13与CRISPRRNA(crRNA)组装时形成一个由crRNA引导的RNA靶向复合物，进行RNA的靶向切割。<br>　　CRISPR-Cas13系统自发现以来，已经被用于RNA编辑、RNA敲除、RNA检测、RNA追踪及成像等。CRISPR-Cas13系统，例如Cas13a、Cas13b等，它们的RNA敲除技术目前已经被应用到许多领域，如植物RNA病毒——芜青花叶病毒(TuMV)，马铃薯Y病毒(PVY)等；哺乳动物细胞单链RNA病毒敲除——甲型流感病毒(IAV)，疱疹性口炎病毒病(VSV)和淋巴细胞性脑膜炎病毒(LCMV)等。这些都已经证明CRISPR-Cas13是破坏RNA病毒有效的工具，CRISPR-Cas13系统将对研究抑制RNA病毒发挥着不可小觑的作用。<br>　　本研究利用CRISPR-Cas13精确靶向切割单链RNA(ssRNA )的能力，评价CRISPR-Cas13系统对动物细胞感染寨卡病毒的防治作用。通过建立CRISPR-Cas13:gRNA双质粒荧光标记系统，并设计选取寨卡病毒基因组上对应的靶位点，使得CRISPR-Cas13靶向切割寨卡病毒单链RNA基因组。然后利用荧光显微镜技术观察带有荧光标记的寨卡病毒减少量，进一步利用流式细胞分选技术对实验结果进行分析，判断CRISPR-Cas13系统靶向切割寨卡病毒的能力。实验发挥CRISPR-Cas13对RNA病毒抑制的潜在作用，为防治寨卡病毒提供了新的技术工具。<br>　　首先，我们设计构建了动物细胞CRISPR-Cas13:gRNA双质粒系统模型，其中包括CRISPR-Cas13以及相关gRNA质粒的构建。选用来自Prevotellasp.P5-125的CRISPR-PspCas13b，CRISPR-PspCas13b蛋白后加上了NES胞质定位信号以及融合了一个绿色荧光蛋白GFP(PspCas13b-GFP-NES)。除此以外还构建PspCas13b相应靶向寨卡病毒的gRNA质粒，我们在寨卡病毒荧光报告系统基因组上选择了9个靶位点(gprM、gE、gNS1-1、gNS1-2、gNS2B、gNS3、gNS4B、gNS5和gmC)。然后，我们将构建好的PspCas13b-GFP-NES:gRNA-(ZIKV)双质粒系统转染到哺乳动物293TDC-SIGN细胞中，再去感染寨卡病毒荧光报告系统ZIKV-mCherry。实验结果证明，PspCas13b-GFP-NES:gRNA-(ZIKV)双质粒系统可以抑制动物细胞中的寨卡病毒的复制。<br>　　综上所述，我们的研究证明了CRISPR-PspCas13b对寨卡病毒的有效抑制作用。基于CRISPR-Cas13:gRNA在细胞中降解ssRNA的能力，我们开发PspCas13b-GFP-NES:gRNA-(ZIKV)双质粒系统来破坏寨卡病毒的复制。这些证据表明，CRISPR-Cas13系统在针对哺乳动物中ssRNA病毒方面具有广泛的潜在用途，将会成为干预RNA病毒的一种有效工具。