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摘要研究背景和目的<br>　　高血压是人类常见慢性病，其发病率逐年上升，严重威胁人类健康。交感神经活动亢进是高血压病的主要特征之一，并且与脑卒中和心力衰竭等疾病的发展预后密切相关。头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla，RVLM)是调控交感神经活动和血压的关键中枢区域，RVLM所含的前交感神经元不仅接受孤束核和室旁核等其它心血管中枢的纤维传入，还发出纤维与脊髓交感节前神经元发生单突触联系，调控外周交感神经活动和心血管功能。因此，深入了解高血压交感神经活动亢进机制对探索高血压发病机理，及开发防治策略具有重要作用和深远意义。<br>　　研究表明G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)激活介导的信号传导是调节神经元活动的重要机制。β-arrestin是一类调节GPCR的多功能蛋白，并广泛存在于心血管系统中。β-arrestin可被G蛋白相关激酶磷酸化后招募，阻碍GPCR与G蛋白的结合，并活化下游的网格蛋白介导受体内吞形成内吞小体，促进其与溶酶体融合。此外，β-arrestin还能激活偏向性信号通路，通过调节MAPK、ERK1/2等信号分子发挥生物学效应。本实验室前期研究证实自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR )RVLM内β-arrestin1表达明显下降，而β-arrestin2表达没有变化。因此，我们的研究重点集中在β-arrestin1对心血管中枢调控的作用和意义，重要的是我们发现RVLM内过表达β-arrestin1发挥降低血压和交感神经活动的效应。但在RVLM内β-arrestin1降低血压和交感神经活动亢进的具体机制尚未明确。因此，本课题主要目标是明确在心血管调控中枢RVLM内β-arrestin1对心血管功能调节的具体机制。<br>　　研究显示，线粒体(mitochondria)结构与功能异常在心血管疾病发生发展中发挥了重要作用。线粒体是细胞内重要的细胞器，与能量产生和物质代谢密切相关。研究报道高血压大鼠心肌细胞线粒体质量和密度下降，并伴随线粒体肿胀和嵴的碎裂消失，是导致心力衰竭发生的重要原因。线粒体靶向药物MitoQ可改善高血压大鼠内皮功能降低心肌肥厚，从而发挥降血压的作用。这些证据提示线粒体功能在循环系统功能调节中发挥着重要作用，但目前对于RVLM内线粒体的功能及其对心血管功能的调节意义并不清楚。研究发现心血管调控中枢氧化应激增强是导致高血压交感亢进的重要机制。本实验室前期开展了RVLM内氧化应激与心血管功能中枢调控机制的相关研究，证实高血压(病理)状态下RVLM内氧化应激水平明显增强，抑制氧化应激能降低血压和交感神经活动。众所周知，线粒体是细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的重要来源，当线粒体损伤时会产生大量ROS。那么，在高血压状态下，RVLM内氧化应激增强是否由线粒体损伤所引起，以及RVLM内β-arrestin1是否通过保护线粒体功能来改善高血压和交感神经活动亢进仍未明确。因此，我们旨在阐明RVLM内线粒体功能对于血压中枢调节的影响，以及β-arrestin1通过改善线粒体功能参与血压和交感神经活动中枢调节的作用及意义。<br>　　线粒体损伤后可通过线粒体自噬(mitophagy)机制进行自我调节来维持其功能的稳定，线粒体自噬可帮助功能障碍的线粒体特异性的靶向溶酶体(哺乳动物)或液泡(酵母)进行降解，不仅可以高效清除损伤线粒体防止ROS聚集，而且可以为新生线粒体提供所需能量和物质。由此可见，线粒体自噬在维持线粒体功能中发挥重要作用，其中最主要且研究最为广泛的是Parkin介导的线粒体自噬途径。在小鼠心肌肥厚模型中，线粒体结构损伤并伴随着氧化呼吸功能下降，而增强靶向Parkin依赖的线粒体自噬通路可恢复线粒体的结构和功能，成为对抗心肌肥厚的有效策略。在中枢神经系统中，去乙酰化酶激动剂白藜芦醇可增强Parkin表达，通过增加线粒体自噬保护线粒体功能，从而改善帕金森病。这些证据提示Parkin介导的线粒体自噬途径具有保护线粒体功能的作用。那么β-arrestin1能否通过增强Parkin介导的线粒体自噬通路来达到保护线粒体功能的目的呢？<br>　　根据以上背景，我们提出本课题的假设：交感中枢β-arrestin1通过Parkin介导的线粒体自噬通路改善高血压中枢线粒体功能，继而发挥降低血压效应。本研究首先观察高血压状态下RVLM线粒体结构和功能是否损伤，并且损伤线粒体后是否会导致血压升高；其次过表达β-arrestin1是否会改善SHR大鼠RVLM线粒体结构和功能；最后探究过表达β-arrestin1对线粒体功的作用是否与Parkin介导的线粒体自噬途径有关。<br>　　研究方法<br>　　研究分为整体动物实验和细胞实验两部分。动物实验主要选取16周龄，体重300g左右的雄性正常血压WKY大鼠和SHR。通过电镜、ATP检测试剂盒、膜电位检测试剂盒、Seahorse实验和Westernblot等方法检测线粒体功能。在WKY大鼠RVLM微量注射线粒体功能抑制剂Rotenone后观察血压等心血管功能的变化。观察RVLM注射腺相关病毒过表达β-arrestin1对血压、心率、血浆去甲肾上腺素浓度、线粒体功能和线粒体自噬水平的作用。在血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激PC12细胞模拟线粒体损伤模型上，通过免疫共沉淀观察β-arrestin1是否能与Parkin结合并增强线粒体自噬水平，并通过荧光探针方法观察过表达β-arrestin1对线粒体自噬和线粒体特异性活性氧的作用。<br>　　研究结果<br>　　一、高血压大鼠交感中枢RVLM内线粒体损伤增加<br>　　通过组织透射电镜比较观察WKY和SHR大鼠RVLM中线粒体结构，发现SHR大鼠RVLM线粒体电子密度降低，线粒体嵴断裂，部分线粒体肿胀并出现空泡化改变，单位面积内损伤线粒体数量增加明显。与WKY大鼠相比，发现SHR大鼠RVLM线粒体膜电位降低，ATP含量下降，线粒体自噬、融合、分裂水平降低。提示在高血压状态下，RVLM的线粒体结构和功能都出现了明显损伤。为了探究RVLM内线粒体损伤与血压调控之间的关系，相比于溶剂对照，WKY大鼠RVLM双侧急性微量注射线粒体抑制剂Rotenone(100 nM, 100 nL)后血压明显升高(血压变化值：4.2±0.3mmHgvs.32±1.4mmHg)，提示损伤RVLM线粒体可以诱导升压效应。<br>　　二、高血压大鼠交感中枢RVLM内过表达β-arrestin1后保护线粒体功能<br>　　为探究RVLM内β-arrestin1对线粒体结构和功能的调节作用，首先在WKY与SHR大鼠RVLM注射过表达β-arrestin1的腺相关病毒，观察β-arrestin1表达情况和血压变化。通过Westernblot检测RVLM内β-arrestin1蛋白水平明显增加，提示β-arrestin1已成功表达在RVLM。β-arrestin1过表达明显降低SHR的血压(SHR+AAV-GFPvs.SHR+AAV-Arrb1:184.9±3.3mmHgvs.161.5±2.7mmHg)和血浆去甲肾上腺素浓度。通过组织透射电镜发现过表达β-arrestin1能明显降低单位面积下损伤线粒体数量，提示过表达β-arrestin1可改善高血压RVLM内线粒体结构。通过检测ATP含量、线粒体膜电位和seahorse实验发现过表达β-arrestin1可增加ATP含量、线粒体膜电位水平和线粒体氧耗量，提示β-arrestin1可保护RVLM线粒体功能。<br>　　三、β-arrestin1通过Parkin介导的线粒体自噬通路保护线粒体功能<br>　　为了排除胞质中蛋白影响，准确评价线粒体自噬的水平，我们首先将大鼠RVLM内线粒体提出，然后通过WesternBlot观察β-arrestin1对线粒体自噬蛋白Parkin、P62和LC3Ⅱ水平。结果显示，β-arrestin1过表达后可增加Parkin、P62及LC3Ⅱ蛋白表达水平，提示在高血压大鼠中枢RVLM过表达β-arrestin1可增加线粒体自噬水平。在PC12细胞上构建线粒体损伤模型上，通过免疫共沉淀的方法发现β-arrestin1可与Parkin结合，而过表达β-arrestin1后Parkin结合水平增加。在过表达β-arrestin1的SHR模型上，通过免疫荧光方法进一步验证了β-arrestin1与Parkin存在共定位情况。而后通过线粒体氧化磷酸化抑制剂CCCP在细胞模型上诱导线粒体自噬发现，过表达β-arrestin1可增加P62和LC3Ⅱ的蛋白表达水平。通过线粒体探针MitoTracker与溶酶体探针LysoTracker共定位判断线粒体自噬水平发现，过表达β-arrestin1后可增加线粒体自噬水平。在细胞模型上，通过MitoSOX探针检测线粒体特异性活性氧水平发现，过表达β-arrestin1可降低线粒体特异性活性氧水平。<br>　　研究结论<br>　　高血压状态下RVLM内线粒体结构和功能损伤，并且线粒体功能损伤后可导致血压升高。中枢β-arrestin1可通过与Parkin直接结合的方式增强Parkin介导的线粒体自噬通路，从而保护线粒体功能，参与血压和交感神经活动的中枢调控。