SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进海水淹溺性急性肺损伤中肺上皮细胞铁死亡的机制研究*-论文-万方医学网

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SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进海水淹溺性急性肺损伤中肺上皮细胞铁死亡的机制研究*

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摘要近年来，随着我国海洋军事力量的显著加强，溺水事故逐步受到关注与重视。因海中溺水引起的淹溺性急性肺损伤（seawater drowning-induced acute lung injury,SWD-ALI），继而导致呼吸循环系统衰竭甚至死亡，已成战斗性减员不容忽视的重要因素之一。减轻SWD-ALI，对改善海水淹溺患者的临床预后、减少战斗性减员具有重要意义。 　　目前研究表明氧化应激参与了ALI的病理过程。有研究指出，氧化应激与铁死亡关系紧密，诱导了细胞的铁死亡。当铁过量存在于细胞和组织中时，会破坏氧化还原稳态并催化ROS的传播，从而导致氧化应激，继而导致铁依赖的细胞死亡。 　　铁死亡是非细胞凋亡性的细胞死亡形式，有两大主要特征，一是铁依赖性，二是ROS堆积为特点。近年来发现，铁死亡是与缺血性器官损伤、神经变性和癌症相关的细胞死亡的关键机制，充分参与了细胞的代谢、氧化、及各种疾病如外伤性脑损伤、肺缺血再灌注损伤、帕金森氏病、肺部肿瘤、肺损伤。铁死亡在肺损伤中发挥了重要的调控作用，但铁死亡是否参与到海水淹溺性肺损伤的病理变化过程中，具体机制是怎样的，仍有很多研究空白。 　　已有研究工作证实，TNFAIP3的表达与铁死亡正相关。通过生信分析发现SOX9为TNFAIP3的上游转录因子，SOX9可使TNFAIP3的表达上调。因此我们推测，下调SOX9是否能抑制TNFAIP3的表达从而减少铁死亡，起到减轻海水诱导的急性肺损伤的作用呢？ 　　研究目的： 　　（一）构建海水淹溺性肺损伤的细胞模型，并通过转录组测序技术筛选差异基因，发现在肺损伤过程中高表达的差异基因； 　　（二）验证TNFAIP3对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的作用； 　　（三）通过生信分析筛选调控TNFAIP3的转录因子SOX9，进一步验证转录因子的表达与TNFAIP3-ACSL4通路、铁死亡的相关性； 　　（四）探讨转录因子SOX9和差异表达基因TNFAIP3于在体实验中，对小鼠肺损伤铁死亡的作用。 　　研究方法： 　　（一）海水淹溺性肺损伤细胞模型的建立及差异表达基因的筛选和验证 　　首先探究建立海水淹溺性肺损伤BEAS-2B细胞模型的条件：海水浓度及海水刺激时间。再用转录组测序技术筛选出差异基因。 　　（二）TNFAIP3对海水刺激诱导的BEAS-2B细胞铁死亡的作用研究 　　采用流式细胞术对细胞的死亡情况进行评估；采用ROS的流式细胞检测，明确细胞中ROS的变化，反应细胞脂质过氧化的情况；采用Ferrostatin-1、DFO、Z-V AD-FMK、GSK’872处理细胞，确定细胞死亡的主要类型；用MDA和GSH的试剂盒检测细胞内含量变化，反应铁死亡的水平；采用JC-1探针对MMP进行检测。同时采用Western blot对TNFAIP3和铁死亡相关蛋白TRF、GPX4、ACSL4测定，探讨TNFAIP3与铁死亡的相互作用关系。 　　通过质粒转染的BEAS-2B细胞上调TNFAIP3的表达，并进行相关实验，实验方法同上一个步骤。 　　通过siRNA转染BEAS-2B细胞进行实验，实验方法同上一个步骤。 　　（三）转录因子SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究 　　我们采用UCSC网站和JASPAR网站查找出靶向TNFAIP3启动子区域的转录因子SOX9。紧接着我们采用荧光素酶报告基因实验，验证SOX9与TNFAIP3启动子的靶向关系。然后采用质粒对SOX9进行细胞转染，以上调SOX9的表达，从而研究TNFAIP3的表达情况。最后采用siRNA对SOX9进行细胞转染后，用Western blot的方法对SOX9、TNFAIP3和铁死亡相关蛋白进行检测，验证SOX9-TNFAIP3-ACSL4通路对铁死亡的调控作用。 　　（四）海水淹溺诱导的小鼠急性肺损伤中铁死亡的验证研究 　　首先建立小鼠SWD-ALI模型。进行血气分析并计算OI；肺组织HE染色，观察病理改变，并行肺组织损伤评分；肺组织称干湿重量，计算W/D ratio；对肺组织切片铁死亡、凋亡相关蛋白进行免疫荧光染色。最后用Western blot的方法对SOX9、TNFAIP3和铁死亡相关蛋白进行检测，验证在体实验和细胞实验的结果是否具有一致性。 　　研究结果： 　　（一）海水淹溺性肺损伤细胞模型的建立及差异表达基因的筛选和验证 　　海水淹溺性肺损伤BEAS-2B细胞模型，采用30%海水浓度配制的DMEM培养基培养细胞6h。转录组测序中，我们选取高差异倍数，显著性明显的TNFAIP3基因进行研究。TNFAIP3基因在SW组中表达上调显著。 　　（二）TNFAIP3在海水刺激诱导的BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究 　　1、TNFAIP3在海水淹溺BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性 　　（1）流式检测海水淹溺导致了明显的细胞死亡，且该死亡与铁死亡密切相关，与细胞凋亡和细胞坏死关联性较低；海水淹溺刺激下BEAS-2B细胞产生了过多的ROS； 　　（2）海水淹溺能引起G SH消耗和MD A的增多； 　　（3）海水刺激BEAS-2B细胞严重影响了线粒体功能并促进铁死亡； 　　（4）SW组中TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平升高明显，GPX4蛋白表达水平明显降低； 　　（5）以上各项指标的变化均可别铁死亡抑制剂抑制。 　　2、TNFAIP3在质粒转染的BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性 　　（1）TNFAIP3质粒转染细胞能诱导细胞死亡，也会产生过多的ROS； 　　（2）TNFAIP3质粒转染细胞能引起GSH消耗和MDA的增多； 　　（3）TNFAIP3质粒转染的细胞上调了TNFAIP3的表达后严重影响了线粒体功能并促进铁死亡； 　　（4）质粒转染的细胞中，TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平升高明显、GPX4蛋白表达水平明显降低； 　　（5）以上各项指标的变化均可别铁死亡抑制剂抑制。 　　3、TNFAIP3在siRNA转染的BEAS-2B细胞中与铁死亡的相关性 　　（1）siRNA转染的细胞能有效抑制细胞的死亡；经siRNA转染的细胞胞内ROS显著减少； 　　（2）经siRNA转染后的细胞能降低MDA堆积并减少GSH的消耗； 　　（3）siRNA转染的细胞下调了TNFAIP3的表达后，减轻了对线粒体功能的影响，减少了铁死亡； 　　（4）siRNA转染细胞中，TNFAIP3、TRF、ACSL4蛋白表达水平明显降低、GPX4蛋白表达水平明显升高。上述结果提示siRNA转染细胞后TNFAIP3表达下调，铁死亡相关蛋白的表达受到负调控，限制了铁死亡。 　　（三）转录因子SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路促进BEAS-2B细胞中铁死亡的作用研究 　　1、TNFAIP3的转录因子SOX9的筛选与确认 　　我们采用UCSC网站和JASPAR网站查找出靶向TNFAIP3启动子区域的转录因子SOX9； 　　2、在海水淹溺细胞中SOX9的表达是显著上调的； 　　3、SOX9质粒转染的细胞中，SOX9的高表达可以诱导TNFAIP3的高表达； 　　4、海水淹溺细胞中SOX9的高表达伴随着TNFAIP3的高表达，同时诱发了铁死亡；而si-SOX9转染的细胞SOX9表达降低后伴随着TNFAIP3的表达降低，铁死亡得到了有效的抑制。SOX9通过TNFAIP3-ACSL4通路调节铁死亡。 　　（四）海水淹溺诱导的小鼠急性肺损伤中铁死亡的验证研究 　　1、小鼠动脉血气相关指标及氧合指数的变化 　　SW组中，pH值明显下降，pO2值明显下降，pCO2值明显上升，SaO2明显下降，OI明显下降，Lac明显上升，HCO3-明显上升。结果提示海水淹溺后的小鼠，呼吸氧合显著降低，气体交换减少，呈现明显的呼吸性酸中毒合并代谢性酸中毒，已达到急性肺损伤的诊断标准。 　　2、肺组织病理改变及肺组织损伤评分 　　HE染色后观察发现，部分肺泡壁增厚、水肿、出血，肺泡间隙减少，肺泡未扩张，肺实质化；部分肺泡破坏融合成肺大疱；肺泡间隙中性粒细胞浸润。SW组的小鼠的肺损伤评分显著高于Ctl组。 　　3、肺组织湿干比 　　SW组的肺组织湿干比相较于Ctl组明显升高，提示海水淹溺后的小鼠肺组织肺水肿明显加重。 　　4、肺组织铁死亡相关蛋白GPX4、PTGS2的免疫荧光染色 　　海水淹溺后的小鼠肺组织中GPX4的表达下降、TUNEL的表达上调、PTGS2的表达上调。 　　5、肺组织SOX9、TNFAIP3、GPX4、ACSL4的蛋白印迹检测 　　海水淹溺的小鼠肺组织中，SW组相较于Ctl组，SOX9、TNFAIP3、ACSL4的蛋白表达升高，GPX4的蛋白表达降低。结果与细胞实验一致。 　　研究结论： 　　（一）TNFAIP3参与了海水刺激诱导的BEAS-2B细胞的铁死亡过程，TNFAIP3的高表达可以诱导铁死亡； 　　（二）转录因子SOX9可以通过TNFAIP3-ACSL4通路靶向调控铁死亡，抑制SOX9的表达可以减少铁死亡的发生； 　　（三）小鼠在体实验中SOX9、TNFAIP3及铁死亡相关蛋白的表达与细胞实验相一致。