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摘要眼角膜暴露于外部环境，极有可能受到各种损伤。角膜化学损伤占眼科急诊的11.5%至22.1%，其中，碱烧伤通常比其他类型的损伤更严重，这是由于碱试剂亲脂性的特征使其能迅速穿透组织，造成更为严重的创伤。即使采取及时的临床治疗，大多也会由于伤口愈合过程中形成角膜瘢痕和新生血管而造成永久性失明。因此，角膜的碱烧伤修复不仅是基础科学研究的热点，也是一个急需解决的重要医学问题。然而，大量的研究多集中在药物对角膜碱烧伤的影响上，对损伤引起的系统性应答机制研究较少，不利于靶点药物的筛选。<br>　　角膜碱烧伤引发的应答是一个复杂的级联反应，涉及细胞因子介导下的角膜上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用，其中最为重要的是损伤引起的角膜血管新生、纤维化和严重的炎症反应。近年来，雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）被发现具有抗角膜损伤引起的纤维化和血管生成作用，但其介导哺乳动物雷帕霉素靶点（MammaliantargetofRapa,mTOR）调节角膜血管新生的机制研究甚少。本研究通过建立小鼠角膜碱烧伤模型，采用Hematoxylin&Eosin（H&E）染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应（Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR）、亚硫酸氢钠测序PCR（BisulfitesequencingPCR,BSP）、电泳迁移率实验（Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA）、蛋白免疫印迹法（Westernblot,WB）、流式细胞术（Flowcytometry,FCM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）技术，从形态、组织和分子水平，确定小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控机制、转录因子调控机制、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控机制、以及角膜碱烧伤引起的机体免疫应答与药物干预下的修复机制，得到以下结论：<br>　　Ⅰ.碱烧伤引起的小鼠角膜浑浊化及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控、转录因子调控、及MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控：<br>　　1.碱烧伤引发血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）介导的血管新生，并诱导静止的角质细胞分化为成纤维细胞，成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smoothmuscleactin,α-SMA）转化为肌成纤维细胞导致角膜纤维化。Rapa通过降低VEGF和α-SMA介导的血管生成和角膜纤维化，减轻角膜碱烧伤引起的损伤。<br>　　2.碱烧伤诱导的角膜细胞增殖主要来自于基质细胞，而Rapa诱导的损伤角膜细胞增殖主要来自于上皮细胞。此结果显示出Rapa作为治疗角膜碱烧伤备选药物的可行性：能有效促进损伤角膜上皮细胞的增殖以达到修复创伤面的目的，并可能抑制因损伤引起的基质细胞增殖，保证了角膜基质的均一性和良好的光线折射性。<br>　　3.小鼠角膜碱烧伤可诱导DNA甲基转移酶3b（DNAmethyltransferases3b,Dnmt3b）表达升高并介导mTOR基因启动子发生从头DNA甲基化修饰，而Rapa通过抑制Dnmt3b的表达降低碱烧伤诱导的甲基化。这种调控机制在如碱烧伤类的损伤中主要借助于基因启动子区一些关键的CpGs位点实现其对转录水平的影响。<br>　　4.转录因子ETS变体5（ThetranscriptionfactorETS-variant5,ETV5）结合在Rapa诱导的mTOR基因去甲基化位点并负调控基因表达，在角膜碱烧伤后的Rapa修复中发挥重要作用。<br>　　5.小鼠角膜碱烧伤模型中，损伤诱导PI3K/AKT/mTOR信号通路活化和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-induciblefactor-1alpha,HIF-1α）高调，引起VEGF高表达。因此得到一条角膜碱烧伤引起的血管生成调控轴：PI3K/AKT/mTOR/HIF-1/VEGF。<br>　　6.MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路通过mTOR分子调控VEGF的表达，因此，对以上通路的联合抑制，有利于血管生成疾病的治疗。<br>　　Ⅱ.小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下的免疫应答：<br>　　1.角膜碱烧伤引起包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的白细胞浸润，它们通过角膜缘迁移进入基质，释放白介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）和肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor-alpha,TNF-α），启动Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）和NOD样受体家族3（Nucleotidebindingoligomerizationdomain-likereceptors,NLRP3）炎症信号通路，招募基质金属蛋白酶-2（Matrixmetalloproteinases-2,MMP-2），发展了损伤角膜的急性炎症反应和与之相关的血管生成。Rapa通过抑制白细胞的浸润和炎症因子的表达降低了碱烧伤引起的角膜炎症反应和炎症相关的血管生成。<br>　　2.Rapa促进角膜中碱烧伤诱导的CD4+T细胞向CD4+CD25highTreg细胞转化。