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摘要肺炎链球菌是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性致病菌，是引起鼻窦炎、中耳炎、菌血症及脑膜炎等肺炎链球菌性疾病的主要病原体，婴幼儿、老年人及有基础疾病的患者是其主要的感染人群。据估计，每年都有数十万儿童死于肺炎链球菌性疾病，仅仅2018年全球死于肺炎链球菌感染的五岁以下儿童约有29.4万名，这些病例大部分来自经济和卫生条件落后的发展中国家。肺炎链球菌性疾病治疗的首选方案是抗生素，但肺炎链球菌对常用抗生素逐渐产生耐药性，增加了治疗的难度，这使得肺炎链球菌疫苗的发展变得极为重要。<br>　　肺炎链球菌多糖疫苗PPV23可诱导非T细胞依赖的免疫应答，但它不具有免疫记忆性，且很难使2岁以下的婴幼儿产生保护性免疫。肺炎链球菌多糖结合疫苗PCVs将荚膜多糖与蛋白载体结合，从而将多糖抗原转变为T细胞依赖性抗原，具有免疫记忆性，但其工艺复杂、价格昂贵，很难在世界范围内广泛使用。更重要的是，随着这两种基于荚膜多糖的疫苗的使用，非疫苗覆盖血清型的肺炎链球菌导致的疾病逐年增加。因此，研发一种不依赖荚膜多糖且能诱导各年龄段易感人群产生保护性免疫的肺炎链球菌疫苗刻不容缓。本研究制备了一种新型肺炎链球菌蛋白多糖结合疫苗，通过生物素-链霉亲和素之间的非共价作用将肺炎链球菌疫苗候选蛋白与荚膜多糖连接，克服了以往疫苗血清型覆盖率低、血清型替代以及无法对婴幼儿产生保护性免疫的缺陷，且工艺简单，更有机会在全球范围内推广使用进而形成群体免疫。本研究分为以下两个部分：<br>　　1.新型肺炎链球菌蛋白多糖结合疫苗的制备<br>　　选取表达后稳定性高、在极端条件下仍保持生物素结合能力的核心链霉亲和素序列SA，与肺炎链球菌疫苗候选蛋白PspA4和PsaA-PspA23融合表达纯化，获得核心链霉亲和素的融合蛋白PspA4-SA和PsaA-PspA23-SA。<br>　　CDAP活化带有羟基的多糖形成氰酸酯，与生物素Bio-PEG3-胺所携带的氨基在适当的pH下发生反应合成生物素化多糖Bio-CPS4，用红外光谱进行表征。<br>　　借助链霉亲和素与生物素之间的非共价作用，将融合蛋白PspA4-SA和PsaA-PspA23-SA与生物素化多糖Bio-CPS4共同孵育，得到蛋白多糖结合物PspA4-SA-Bio-CPS4和PsaA-PspA23-SA-Bio-CPS4，使用高效液相色谱对其表征。<br>　　利用分子筛除去结合物中的游离蛋白，用硫酸蒽酮法分别检测结合物中游离多糖及总糖的含量，按照一定的比例混合免疫。<br>　　2.新型肺炎链球菌蛋白多糖结合疫苗的有效性评价<br>　　将小鼠分为蛋白多糖结合疫苗实验组(PspA4-CPS4+PsaA-PspA23-CPS4)、蛋白对照组(PspA4-SA+PsaA-PspA23-SA)、多糖对照组(CPS4)、阳性对照PCV13组以及阴性对照PBS组，分别使用相应的免疫原进行免疫和评价,共免疫三次，每次间隔14天。在本研究中，有效性评价主要包括体外的调理吞噬试验和体内免疫攻毒保护实验。其中体内评价包括三部分:(1)免疫后的血清检测抗原特异性抗体效价及分型;(2)免疫后小鼠的脾脏细胞使用PspA4和PsaA-PspA23蛋白抗原刺激检测Th1、Th2和Th17细胞因子;(3)动物免疫后攻毒保护性测定：选取血清型和PspA亚类均在结合疫苗保护范围内的ATCCBAA334(血清型4、PspA家族2亚类3)以及血清型和PspA亚类均不在结合疫苗保护范围内的ATCC6308(血清型8、PspA家族1亚类1)对小鼠进行攻毒进而检测疫苗对小鼠的保护效力以及广谱的交叉反应性。在体外评价中，利用调理吞噬试验体外检测结合疫苗诱导产生的抗体活性。<br>　　综上所述，本研究制备了一种新型肺炎链球菌蛋白多糖结合疫苗。在疫苗体外有效性评价中，证明了结合疫苗诱导的抗体活力高于单独蛋白或多糖的免疫组。在疫苗体内有效性评价中，免疫该结合疫苗的小鼠产生了高效价的抗体，且通过细胞因子的检测证明该结合疫苗诱导产生的体液免疫和细胞免疫均强于蛋白对照组和多糖对照组，此外在肺炎链球菌致死剂量的感染下，免疫该结合疫苗的小鼠存活率可达到90%，同时也证明了该疫苗具有交叉保护性和广谱性。