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摘要随着超分子化学研究的不断发展，天然酶和超分子开关的组合在调控酶功能等方面的应用越来越广泛。谷胱甘肽硫转移酶(GST)常存在于哺乳动物、植物、鸟类、昆虫、及微生物中,在解毒、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等方面都发挥着重要的作用。其解析出来的晶体结构呈对称同源二聚体，这为修饰超分子开关提供了有利条件。环糊精(clodextrin，CD)分为α、β、γ三种类型，能够对不同尺寸的客体分子进行包络。研究中，经常将环糊精和偶氮苯组成复合结构。偶氮苯分子及其衍生物在黑暗或可见光环境中以反式构象存在，但是若对其进行紫外光照射处理，其构象则由反式转变为顺式，并且偶氮苯构象的改变是一个可逆的过程。基于偶氮苯的光致异构特性，环糊精-偶氮苯复合结构成为构建光刺激响应智能开关的绝佳组合，用来实现对酶催化功能的调控。<br>　　本论文采用分子动力学模拟方法，搭建了环糊精-偶氮苯超分子开关，并将此超分子开关通过偶氮苯和酶的键连相互作用，选择性修饰于谷胱甘肽硫转移酶(GST)的不同位点上。实验上，在可见光或黑暗条件下，偶氮苯分子以反式构象存在，此时偶氮苯和环糊精能够稳定结合，开关处于闭合状态；转为紫外光照射时，偶氮苯由反式转变为顺式构象，环糊精将从偶氮苯上脱落，开关处于打开状态。与此对应，我们搭建了含有反式和顺式偶氮苯，α-/β-型环糊精的超分子开关体系，并分别修饰于GST的117和124位点，探究了不同环糊精的尺寸、不同的修饰位点对酶结构的影响，以及超分子开关与酶的结合模式与体系稳定性，具体研究内容与研究结果如下：<br>　　(1)基于解析出来GST的晶体结构，选取117位点和124位点引入半胱氨酸Cys进行取代；与此同时用马来酰亚胺对偶氮苯进行修饰，这样合成的偶氮苯衍生物Azo-MAM作为客体分子同α-CD/β-CD主体分子进行复合再加以反式力场进行常规分子动力学(Molecular dynamics，MD)模拟。本部分针对反式力场研究包括以下六个模拟体系：α-CD与117位点修饰的偶氮苯衍生物Azo-MAM结合(trans-α117)、α-CD与124位点修饰的偶氮苯衍生物Azo-MAM结合(trans-α124)、α-CD与117和124位点修饰的偶氮苯衍生物Azo-MAM结合(trans-α117/124)和以β-CD作为主体分子对不同位点进行修饰的trans-β117、trans-β124和trans-β117/124三个模拟体系。在结合了β-CD的三个模拟体系中，偶氮苯分子和β-CD的结合亲和力强于结合α-CD的三个模拟体系。β-CD的结合能构建出更加稳定的主客体复合物体系，并且增加了蛋白质结构的紧密程度。此时，环糊精对催化口袋的阻挡效率更高，效果更好。通过对模拟轨迹的分析，阐明了不同尺寸环糊精在调控GST活性效果中具有差异性的原因。<br>　　(2)对结合了β-CD的三个模拟体系trans-β117、trans-β124和trans-β117/124进行轨迹分析，探究不同取代位点对蛋白质构象变化的影响，得出以下结论：偶氮苯衍生物Azo-MAM在Cys117位点的修饰对于GST内部疏水空腔的“开/关”变构至关重要。具体来讲，Cys117位点修饰的蛋白结构在超分子开关所处蛋白的α-helix区域活跃性较低，该结构域更加紧密且疏水性较低，这些特性能够稳定环糊精与GST的结合。GST解析出的晶体结构图显示，GST催化中心位于疏水空腔内部，也就是催化通道的中间位置，Cys117位置距离催化口袋更近，这部分工作说明修饰位点的选择具有重要意义。<br>　　(3)为了探究影响超分子开关打开，即环糊精从偶氮苯和GST上脱落的因素，对以上六个模拟体系搭配使用顺式力场，通过分子动力学模拟，将马来酰亚胺修饰的顺式(cis)偶氮苯与环糊精(α-CD和β-CD)结合，随即构建出六个新的模拟体系cis-α117、cis-α124、cis-α117/124和cis-β117、cis-β124、cis-β117/124，以模拟在超分子开关“开启”时GST的构象状态。模拟结果表明：当偶氮苯分子呈顺式构象时(开关开启)，β-CD因其与GST结合度更高，更难从偶氮苯分子上解离；而α-CD作为超分子开关主体分子时，因其与偶氮苯、GST之间形成作用力更小，使其作为开关更具活力。<br>　　本工作将有助于解释环糊精-偶氮苯超分子开关调控酶催化机制，并对今后超分子开关的设计优化、提高酶的催化效率、改进酶的设计方案提供理论基础和指导。