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摘要研究背景及目的：<br>　　与普通人群相比，2型糖尿病(T2DM)患者有更高的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的风险。T2DM合并NAFLD会加速异常代谢进程，并增加非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化和肝癌的风险。T2DM和NAFLD的病理学表现主要有胰岛素抵抗、脂质代谢异常、炎症反应及遗传因素。T2DM患者并发NAFLD后会增加心血管疾病和其他代谢性疾病如高血脂的风险，严重影响T2DM患者生活质量及生存率。本研究的目的是鉴定T2DM合并NAFLD的血浆差异富集miRNA作为T2DM患者预防及诊断NAFLD的生物标志物，并通过体外实验研究miRNA影响肝细胞胰岛素抵抗和脂质代谢的分子机制。<br>　　方法：<br>　　(1)两阶段病例对照差异富集研究。病例组为T2DM合并NAFLD患者，对照组则为T2DM患者。通过RNA-seq分析第一阶段T2DM合并NAFLDvs.T2DM(样本量：病例/对照=26/9)样本血浆miRNA丰度并筛选出差异富集miRNA(DE miRNA)，利用第二阶段样本(样本量：病例/对照=35/28)进行验证分析，构建DEmiRNA的基因风险评分，用生物信息学数据库预测和注释DEmiRNA的靶基因。(2)全基因组关联研究。对来自英国生物样本库的715例T2DM合并NAFLD患者和21934例T2DM患者总计22649个样本进行GWAS分析，获得T2DM合并NAFLD的风险基因。将DEmiRNA的靶基因与风险基因比对，得到受DEmiRNA调控的风险基因，并用下游研究验证其功能。(3)细胞功能实验。利用棕榈酸和油酸建立胰岛素抵抗合并脂质代谢紊乱肝细胞模型，采用qRT-PCR实验验证DEmiRNA的差异表达情况。<br>　　利用双荧光素酶报告基因实验验证DEmiRNA是否可以直接与靶基因mRNA3’UTR结合。在L02细胞中过表达或抑制DEmiRNA，使用qRT-PCR和WesternBlot技术分析miRNA靶基因的mRNA水平及蛋白质水平的变化。<br>　　建立胰岛素抵抗合并脂质代谢紊乱肝细胞模型的实验组和对照组细胞模型后，过表达DEmiRNA，检测细胞脂质积累情况和胰岛素抵抗情况，使用qRT-PCR和WesternBlotting技术分析DEmiRNA靶基因的mRNA水平及蛋白质水平的变化。<br>　　结果：<br>　　(1)相对于无NAFLD的T2DM患者，并发NAFLD的T2DM患者外周血血浆中循环miR-4646-5p表达水平显著下调(LFC=-1.71，p=5.74×10-4)，靶基因预测软件分析获得了128个miR-4646-5p靶基因。ROC分析显示外周血miR-4646-5p水平在预测T2DM患者的NAFLD并发症时具有较好的特异性。组织特异性分析表明DEmiRNA的靶基因主要集中在肝组织中。<br>　　(2)GWAS发现672个基因与T2DM发展为NAFLD风险显著相关。其中，EXT1，PARVB和NUP50这3个基因是miR-4646-5p预测靶基因。<br>　　(3)双荧光素酶报告基因实验验证了miR-4646-4p直接调节EXT1和PARVB。在L02细胞中过表达miR-4646-5p能显著降低EXT1、PARVB和NUP50的mRNA水平和蛋白质水平，反之抑制miR-4646-5p可以显著升高EXT1、PARVB和NUP50的mRNA水平和蛋白质水平。<br>　　(4)过表达miR-4646-5p降低了胰岛素抵抗合并脂质代谢紊乱的L02细胞的胞内甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量，并且细胞内脂滴积累减少以及胰岛素抵抗水平显著下降，EXT1和PARVB的mRNA水平及蛋白质水平显著降低。<br>　　结论：<br>　　(1)外周血循环miR-4646-5p有望成为T2DM患者合并NAFLD诊断的生物标志物。<br>　　(2)miR-4646-5p可以在体外改善肝细胞的胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱情况，其分子机制可能是miR-4646-5p直接抑制EXT1和PARVB的表达水平，进而影响细胞的脂质代谢及胰岛素抵抗过程。EXT1和PARVB调节脂质代谢的具体分子机制仍有待研究。