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摘要心肌缺血伴随着心脏能量产生和利用的失衡，近年由于代谢组学检测技术的发展，丰富了目前对缺血心肌能量代谢变化的认知。这些代谢变化主要是由于氧供应的减少，导致氧化磷酸化、三羧酸循环等代谢途径受阻，无氧糖酵解产能途径被激活，糖酵解产物乳酸的蓄积，会造成细胞内酸中毒，诱发进一步的心肌功能障碍。因此，调节心肌缺血状态下三羧酸循环与糖酵解，可能为干预缺氧诱导的心肌损伤的新策略。<br>　　线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase 2, PCK2)是连接三羧酸循环与糖酵解、糖异生的关键酶。文献报道，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶各亚型参与生理过程和多种疾病的进展。PCK2过表达可能导致肿瘤细胞等能量代谢异常，抑制PCK2表达可缓解心肌病理学肥大，提示PCK2参与调控损伤心肌的代谢过程。但PCK2在缺血心肌代谢中发挥的作用尚未阐明。<br>　　课题组前期研究表明，曲古菌素A(Trichostatin A, TSA)可明显减轻大鼠心肌缺血损伤，参与心肌缺血的损伤修复。但目前TSA对缺血心肌代谢的调控作用尚未阐明。已有研究表明，TSA可以通过调控肿瘤细胞代谢重编程，包括三羧酸循环和糖代谢等过程，干预细胞增殖与功能。据此，我们推测TSA可能通过调控缺血心肌代谢，影响心肌缺血性损伤。<br>　　研究目的：<br>　　本研究拟采用生物信息学方法分析TSA的作用通路，筛选参与调控缺血心肌代谢的信号通路及关键基因，并通过体内外实验验证关键差异基因在缺血心肌中的作用；进一步探究TSA基于调控心肌缺血代谢的关键差异基因，影响缺血心肌代谢紊乱，干预心肌缺血的作用机制。<br>　　实验方法：<br>　　本实验采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立大鼠心肌缺血模型；采用TTC染色方法，检测TSA对大鼠心肌梗死面积的影响；采用MTT方法，检测TSA对氧糖剥夺条件下大鼠心肌细胞H9c2存活率的影响；通过DAVID网络分析平台对TSA作用靶点及心肌缺血代谢物调控基因进行富集分析；采用RT-qPCR方法，验证调控大鼠缺血心肌代谢的差异表达基因及TSA对其表达的影响；通过瞬时转染siRNA抑制H9c2细胞关键差异基因表达，观察相关代谢指标变化；采用Westernblot和免疫荧光方法，检测不同条件下大鼠心肌缺血组织和氧糖剥夺条件下H9c2细胞中目的蛋白表达；使用JASPAR数据库分析转录因子与关键差异基因作用位点；采用比色法检测大鼠心肌组织及H9c2细胞中三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶活性，以及大鼠血清和H9c2细胞上清中糖代谢关键产物丙酮酸、乳酸含量，评价心肌代谢情况。<br>　　实验结果：<br>　　1.TSA对缺血心肌的保护作用<br>　　TTC染色结果显示，TSA可显著降低心肌缺血大鼠的心肌梗死面积(P<0.05)；MTT检测结果显示，TSA可显著增加氧糖剥夺条件下大鼠心肌细胞H9c2的存活率(P<0.01)。提示TSA能改善缺血引起的心肌损伤。<br>　　2.TSA靶基因及心肌缺血代谢潜在调控基因的生物信息学分析<br>　　基于Pubchem和CTD数据库检索TSA靶基因并进行通路富集分析，得到864条通路TSA参与调控的通路，其中代谢通路(Metabolism)占第2位。对参与调控代谢通路的TSA靶基因进行GoTerms富集和KEGGpathway分析，获得代谢相关通路165条，其中TSA对磷脂酰肌醇信号通路和糖代谢通路具有重要调控作用。<br>　　基于Pubmed数据库检索心肌缺血代谢生物标志物，通过构建metabolite-gene网络分析获得调控代谢标志物基因，并筛选出651个尚未被证明与心肌缺血相关的代谢调控基因。采用蛋白质互作网络分析等方法确定183个核心基因并进行GoTerms富集和KEGGpathway分析，明确三羧酸循环在富集到的代谢通路中占重要地位。<br>　　3.TSA影响缺血心肌代谢的潜在调控基因PCK2表达<br>　　基于TSA靶基因生物信息学分析，采用WesternBlot方法验证结果表明，TSA可激活缺血7天后心肌组织中Akt，抑制mTOR(P<0.05)，提示TSA可通过激活Akt，抑制mTOR保护缺血心肌，调控心肌代谢。<br>　　RT-qPCR检测结果显示，PCK2是缺血心肌组织中与三羧酸循环相关差异表达最明显的基因(P<0.01)，而TSA可显著降低大鼠心肌缺血组织中Pck2mRNA表达(P<0.01)；WesternBlot及免疫荧光实验结果显示，给予TSA后大鼠心肌缺血组织中和氧糖剥夺条件下的H9c2细胞中，PCK2蛋白的表达均有显著下调(P<0.05)。<br>　　4.TSA基于PCK2对缺血心肌代谢的调控作用机制<br>　　三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶检测结果显示，心肌缺血大鼠的心肌组织中琥珀酸脱氢酶活性显著降低(P<0.01)；氧糖剥夺条件下H9c2细胞中琥珀酸脱氢酶活性显著降低(P<0.01)，瞬时转染siRNA抑制PCK2后，增加琥珀酸脱氢酶活性(P<0.05)。<br>　　糖酵解关键产物丙酮酸和乳酸检测结果显示，心肌缺血大鼠血清中丙酮酸、乳酸明显蓄积(P<0.05)；氧糖剥夺条件下H9c2细胞上清中丙酮酸、乳酸明显蓄积(P<0.05)，瞬时转染siRNA抑制PCK2后，减轻丙酮酸、乳酸蓄积(P<0.05)。<br>　　给予TSA后，大鼠心肌缺血组织和氧糖剥夺条件下H9c2细胞中琥珀酸脱氢酶活性显著上升(P<0.01)，血清和细胞上清中丙酮酸、乳酸含量显著下降(P<0.05)。提示TSA通过抑制PCK2改善缺血心肌相关代谢。<br>　　EPD数据库及JASPAR数据库检索分析发现，FoxO1及NR4A1为PCK2的上游转录因子，PCK2与FoxO1存在4个潜在转录结合位点，与NR4A1存在5个潜在转录结合位点。采用WesternBlot验证结果显示，给予TSA后，心肌缺血组织及氧糖剥夺条件下H9c2细胞中FoxO1、NR4A1表达水平显著上升(P<0.01)。<br>　　实验结论：<br>　　1.动物实验表明，PCK2是调控大鼠缺血心肌组织三羧酸循环及糖酵解的关键基因；<br>　　2.细胞实验表明，抑制PCK2表达，可增强氧糖剥夺条件下H9c2细胞中三羧酸循环关键酶琥珀酸脱氢酶的活性，减轻细胞上清乳酸、丙酮酸蓄积；<br>　　3.TSA可通过上调FoxO1、NR4A1表达，抑制PCK2表达，调控缺血心肌代谢，改善心肌缺血损伤。