摘要目的:<br> 明确MEHP暴露对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞增殖和迁移的影响,探讨ERα在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用,为阐明MEHP暴露促进肿瘤细胞增殖和转移作用机制提供科学依据,为寻找神经母细胞瘤的防治靶点提供新思路。<br> 方法:<br> 用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养SH-SY5Y细胞。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露,采用CCK-8法检测SH-SY5Y细胞存活率,根据CCK-8结果确定染毒剂量,实验分组为空白对照组(0μM MEHP)、溶剂对照组(0.1%DMSO)、低剂量组(10μM MEHP)、中剂量组(50μM MEHP)、高剂量组(250μM MEHP)和雌二醇对照组(100nM E2),暴露12h和24h后收集细胞和上清液。采用ERαsiRNA转染SH-SY5Y细胞,并通过Q-PCR验证ERα沉默效率。设置空白对照组(0μM MEHP)、溶剂对照组(0.1%DMSO)、沉默对照组(Transfect+siRNA(siNC))、沉默暴露组(siRNA+250μM MEHP)、暴露组(250μM MEHP)和雌二醇对照组(100nM E2),于24h后收集细胞及其上清液。采用流式细胞术检测细胞周期;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移情况;Q-PCR法和Western Blot法检测ERα、细胞增殖和迁移相关基因mRNA和蛋白表达水平。<br> 采用IBM SPSS24.0进行统计分析,单因素方差分析比较不同染毒剂量组间各指标的差异,采用LSD法进行组间的两两比较;采用t检验比较不同时间段各指标的差异。以P<0.05为差异具有统计学意义。<br> 结果:<br> 1.MEHP暴露12h,MEHP各暴露组SH-SY5Y细胞存活率均显著高于对照组(P<0.05);MEHP暴露24h,125~1000μM MEHP各暴露组细胞存活率均显著高于对照组(P<0.05);且8~1000μM各暴露组24h细胞存活率明显低于12h组细胞(P<0.05)。<br> 2.MEHP暴露12h和24h后,各剂量暴露组SH-SY5Y细胞周期无明显变化(P>0.05);随MEHP暴露时间的增加,中剂量组G1期细胞百分数显著增加(P<0.05),S期和G2期细胞百分数显著降低(P<0.05)。<br> 3.MEHP暴露12h和24h,高剂量组SH-SY5Y细胞迁移距离和迁移数显著高于中剂量组和低剂量组(P<0.05),中剂量组细胞相对迁移数显著高于对照组(P<0.05),中剂量组和低剂量组细胞迁移距离和迁移数明显小于E2组(P<0.05);MEHP暴露24h后,低、高剂量组和E2组细胞迁移距离明显高于MEHP暴露12h的细胞迁移距离(P<0.05)。<br> 4.MEHP暴露12h,高剂量组SH-SY5Y细胞ERαmRNA表达水平显著高于其余各组(P<0.05),且ERαmRNA表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05),MEHP各暴露组和E2组ERα蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05),且ERα表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05);MEHP暴露24h,MEHP各暴露组和E2组ERαmRNA和ERα蛋白表达水平均显著高于对照组(P<0.05),且表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05)。MEHP暴露24h后,中、低剂量组和E2组ERαmRNA表达水平明显高于MEHP暴露12h的表达水平(P<0.05)。<br> 5.MEHP暴露12h,高剂量组SH-SY5Y细胞PCNA mRNA表达水平显著高于其余各组(P<0.05),且其表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05);各MEHP暴露组MMP-2mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05),但其表达水平随MEHP浓度的升高而升高(P<0.05);高剂量组和E2组MMP-9mRNA表达水平显著高于中剂量组、低剂量组和对照组(P<0.05);低、中剂量组TIMP-2mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),高剂量组和E2组其表达水平显著低于对照组(P<0.05)。MEHP暴露12h,中、高剂量组和E2组PCNA蛋白表达水平显著高于低剂量组和对照组(P<0.05);各MEHP暴露组和E2组MMP-2蛋白表达水平显著高于对照组,且其表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05);高剂量组和E2组MMP-9蛋白表达水平明显高于低剂量组和对照组(P<0.05);低、中剂量组TIMP-2蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05),高剂量组和E2组其蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),并且TIMP-2mRNA和蛋白表达水平随MEHP浓度升高而降低(P<0.05)。<br> 6.MEHP暴露24h,各MEHP暴露组和E2组SH-SY5Y细胞PCNA mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),且其表达水平随MEHP浓度升高而升高(P<0.05);中、高剂量组和E2组MMP-2mRNA表达水平显著高于低剂量组(P<0.05);高剂量组和E2组MMP-9mRNA表达水平显著高于其余各组;各MEHP暴露组TIMP-2mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05);MEHP暴露24h,高剂量组和E2组PCNA和MMP-9蛋白表达水平明显高于低、中剂量组和对照组(P<0.05);中、高剂量组和E2组细胞MMP-2蛋白表达水平明显高于低剂量组和对照组(P<0.05);低剂量组和中剂量组蛋白TIMP-2表达水平显著高于对照组(P<0.05),高剂量组和E2组其蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05),并且TIMP-2mRNA和蛋白表达水平随MEHP浓度升高而降低(P<0.05)。<br> 随着暴露时间增加,MEHP暴露24h后,低剂量组PCNA、TIMP-2mRNA表达水平,中剂量组MMP-2、MMP-9和TIMP-2mRNA表达水平以及高剂量组TIMP-2mRNA和蛋白表达水平均显著升高。<br> 7.ERα基因沉默后,与沉默对照组相比,SH-SY5Y细胞暴露于250μM MEHP24h,G1期和G2期的细胞百分数明显减少(P<0.05),S期的细胞百分数显著增加(P<0.05),与正常细胞暴露于MEHP24h相比,G2期的细胞百分数明显减少(P<0.05);ERα基因沉默后,SH-SY5Y细胞中G1期和G2期的细胞百分数明显增加(P<0.05),S期的细胞百分数显著减少(P<0.05)。<br> 8.ERα基因沉默后,SH-SY5Y细胞相对迁移距离和迁移数明显减小,迁移能力明显降低(P<0.05);与正常细胞暴露于MEHP24h相比,ERα基因沉默组细胞相对迁移距离显著缩短、迁移数减少,迁移能力明显降低(P<0.05)。<br> 9.ERα基因沉默SH-SY5Y细胞PCNA、MMP-2、MMP-9mRNA表达水平显著降低(P<0.05),TIMP-2mRNA表达水平显著升高(P<0.05);ERα基因沉默后,给予细胞MEHP处理24h,细胞PCNA、MMP-9mRNA表达水平较ERα基因沉默前显著降低(P<0.05),TIMP-2mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。ERα基因沉默的SH-SY5Y细胞中PCNA、MMP-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),TIMP-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05);ERα基因沉默后,给予细胞MEHP暴露24h,细胞中PCNA、MMP-9蛋白表达水平较ERα基因沉默前显著降低(P<0.05),TIMP-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。<br> 结论:<br> 1.MEHP暴露能够促进SH-SY5Y细胞增殖。<br> 2.MEHP暴露可上调SH-SY5Y细胞增殖相关基因PCNA mRNA和蛋白的表达水平;ERα沉默可引起细胞周期阻滞,降低PCNA蛋白表达水平,表明ERα在MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞增殖中起调控作用。<br> 3.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移,ERα沉默可缩短细胞迁移距离、减少细胞迁移数,削弱细胞的迁移能力,表明ERα在MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞迁移中起调控作用。<br> 4.MEHP暴露可能通过上调MMP-2和MMP-9表达水平、下调TIMP-2表达水平促进SH-SY5Y细胞迁移;ERα沉默可抑制MMP-2和MMP-9表达水平,同时上调TIMP-2表达水平;表明ERα在MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞转移中起调控作用。<br> 5.MEHP可通过拟雌激素作用激活ERα,在SH-SY5Y细胞增殖和转移中起促进作用。
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