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摘要研究背景：<br>　　头面部的软骨缺损是整形美容外科的常见疾病，也是治疗上非常棘手的疾病。常见的头面部软骨缺损包括小耳畸形、鼻畸形以及由各种外伤导致的眼睑、鼻、耳软骨缺损等。由于软骨细胞有限的再生能力使得软骨缺损治疗难度非常大。尤其是大块软骨缺损，很难得到完全治愈，最终导致疼痛甚至畸形。临床上现有的治疗软骨缺损的方法主要是自体、异体软骨移植。然而，由于软骨来源有限，损伤大，供区并发症多、移植后吸收、变形、异体移植的免疫排斥等存在导致这些治疗方法临床应用受限。因此，组织工程软骨应运而生。<br>　　组织工程软骨是将软骨种子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，体内体外培养形成新的复合软骨来填充软骨缺损部位。组织工程软骨近年来发展迅速，支架材料作为组织工程的三大要素之一，是决定组织工程软骨能否成功构建的关键因素。由于软骨在体内尤其是头面部的特殊作用，其对支架材料的要求不仅仅包括一般生物材料要求的可控的降解速率、良好的生物相容性、代谢产物无副作用等，它对支架材料还有一定的力学要求。因此，目前单纯的天然材料很难达到这一目的。多种材料尤其是天然材料与高分子人工合成材料复合构建软骨支架仍是组织工程支架的研究热点。<br>　　然而，复合支架能否应用于临床主要取决于其在体内植入后宿主对其免疫反应的轻重。这也是目前多种体外成功构建的组织工程软骨无法临床应用的主要瓶颈。因此，明确了解复合支架在体内引起的免疫反应的变化，尤其是其体内长期植入的稳定性是获取最终理想组织工程支架的前提条件。<br>　　因此本研究中我们构建了不同明胶浓度下的脱胶蚕丝/丝素蛋白/明胶(S/SF/G)复合支架，利用脱胶蚕丝增加支架的力学强度，同时我们掺入了聚乳酸多孔微球构建脱胶蚕丝/丝素蛋白/明胶/聚乳酸多孔微球(S/SF/G/PLLA-PMs)支架，利用PLLA多孔微球进一步增加其力学强度，以期在增加力学强度的同时，利用其多级孔隙结构构建更加良好的软骨组织，同时利用明胶RGD序列改善聚乳酸表面疏水性，借助明胶的两性作用中和聚乳酸代谢产物产生的炎症刺激，最终构建出符合组织工程软骨支架各项要求的理想支架。我们通过详细评估复合支架的理化性能、体内体外成软骨效果、以及体内植入后短期、长期免疫排斥反应全方位评估该支架构建组织工程软骨及临床应用的可能性。<br>　　研究目的：<br>　　1.评估不同明胶浓度下S/SF/G与S/SF/G/PLLA多孔微球支架理化性能。<br>　　2.明确不同明胶浓度下S/SF/G与S/SF/G/PLLA多孔微球支架体外成软骨能力。<br>　　3.明确不同明胶浓度下S/SF/G与S/SF/G/PLLA多孔微球支架在裸鼠和猪体内成软骨能力。<br>　　4.明确S/SF/G与S/SF/G/PLLA多孔微球支架在体内短期和长期稳定性。<br>　　研究方法：<br>　　第1部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架表征<br>　　1.利用光镜、电镜观察支架结构，包括孔隙连通情况、孔径大小，微球分布情况。<br>　　2.对支架溶胀性能、降解性能、力学性能、化学结构进行分析，明确不同支架间理化性能差异。<br>　　3.分离培养软骨细胞，并对支架材料的生物相容性、细胞粘附等进行检测，明确各组支架作为软骨支架的可能性。<br>　　第2部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架体外成软骨研究<br>　　1.利用光镜、电镜观察不同培养时间细胞在支架上的生长情况。<br>　　2.利用DNA定量试剂盒、羟脯氨酸检测试剂盒、DMMB方法检测体外培养复合软骨总胶原、糖胺聚糖的分泌情况。<br>　　3.利用Real-timePCR检测体外成软骨相关基因的表达情况。<br>　　4.利用WesternBlot、组织化学染色检测体外成软骨相关蛋白的表达情况。<br>　　第3部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架体内成软骨研究<br>　　1.裸鼠、猪体内植入体外培养的支架-细胞复合物。<br>　　2.大体观察植入不同时间植入物变化。<br>　　3.HE、番红O-固绿染色、免疫组织化学染色体内成软骨情况。<br>　　第4部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs支架-细胞复合物体内急慢性免疫反应研究<br>　　1.猪体内植入体外培养的支架-细胞复合物。<br>　　2.利用Real-timePCR检测体内不同时间炎症相关基因的表达情况。<br>　　3.利用免疫荧光及组织化学染色检测体内不同时间免疫细胞表面标志物及纤维化标志物的表达情况。<br>　　研究结果：<br>　　第1部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架表征<br>　　1.S/SF/G-7%平均孔径307±142um，S/SF/G-9%平均孔径273±167um。PLLA多孔微球平均粒径为100-300μm，平均245±35μm，孔径为20-40μm，平均27±4.8μm。支架孔隙连通，分布均匀。<br>　　2.含有PLLA多孔微球支架较不含多孔微球支架溶胀率、降解率、孔隙率低，且随着明胶浓度增加溶胀率、降解率没有明显变化，而孔隙率一定程度下降。FTIR分析可见明显的PLLA官能团和蛋白质β-折叠特征峰。<br>　　3.各组支架细胞相容性良好，有无微球对细胞粘附增殖没有明显影响，明胶浓度的提高在一定程度上提高了细胞增殖和粘附。<br>　　第2部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架构建组织工程软骨的体外研究<br>　　1.大体观察，随着时间推移软骨形成情况越来越好，且随明胶浓度增加体外成软骨效果越好；相同明胶浓度下，有微球支架-细胞复合物形态更完整，软骨形成更好。<br>　　2.体外培养4周软骨细胞分泌大量细胞外基质，且有无微球对胶原及糖胺聚糖影响不大，但明胶浓度的提高则明显促进了细胞外基质的分泌和成软骨相关基因和蛋白的表达；体外培养8周各组支架细胞外基质分泌较4周均有一定程度增加，尤以S/SF/G/PLLA-PMs-9%最为明显。且在9%明胶浓度下含有多孔微球的复合支架细胞外基质分泌较无微球组更为旺盛。<br>　　第3部S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs复合支架体内成软骨研究裸鼠体内植入8周可见四组支架-细胞复合物形态完好，组织学显示二型胶原强阳性表达，猪体内移植后2周支架材料出现一定程度挛缩，但细胞外基质及成软骨相关蛋白表达仍呈阳性，且9%明胶浓度下软骨复合物存活情况更好。体内8周后无PLLA微球支架降解明显，含有PLLA微球支架能够维持其完整性，、各组支架均无明显的软骨标志物的表达。<br>　　第4部分S/SF/G与S/SF/G/PLLA-PMs支架-细胞复合物体内急慢性免疫反应研究<br>　　1.体内不同时间炎症相关基因表达显示在移植2周内，含有PLLA微球组炎性因子表达量较无微球组明显增高，体内移植2个月后各组炎性因子均有明显下降。<br>　　2.体内免疫荧光及免疫组织化学染色结果显示，在体内1周内免疫反应以中性粒细胞和巨噬细胞为主，体内1-2周左右则以巨噬细胞为主，在体内2周及以后B淋巴细胞也参与其中，然而2周内的免疫组化结果显示有无PLLA多孔微球对免疫细胞的种类和分布影响不大。在体内2周出现了纤维化相关标志物的表达，且随时间推移表达量逐渐增加。其分布在有无微球组出现明显差异，在微球内部极少表达，且组织化学结果显示COL1A1表达在有PLLA微球组明显下降。<br>　　研究结论：<br>　　1.S/SF/G及S/SF/G-PLLA-PMs支架具有良好的理化性能及生物相容性可以作为构建组织工程软骨的支架材料。<br>　　2.PLLA多孔微球的加入能够增加复合支架的力学性能，延缓支架降解。<br>　　3.明胶浓度越高，复合支架体内外成软骨性能越优良，9%明胶浓度复合支架较7%明胶复合支架更适宜作为组织工程软骨支架。<br>　　4.体内植入早期，S/SF/G-PLLA-PMs支架较S/SF/G支架炎症反应更为剧烈。<br>　　5.体内长期培养S/SF/G-PLLA-PMs支架较S/SF/G更稳定，PLLA多孔微球的存在可以延缓体内长期培养后血管长入，纤维化产生。