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摘要研究背景：<br>　　多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种累及全身多个系统，以影响育龄期女性生殖健康为主的异质性疾病,也是女性排卵性不孕的最主要病因之一。PCOS的病理表现主要为体内激素水平紊乱、卵泡发育受阻及排卵障碍、血清雄激素异常升高、胰岛素抵抗及肥胖等。该病不仅影响女性的生殖功能，而且此类患者发生2型糖尿病，心血管疾病，子宫内膜癌等远期并发症的风险明显增加。尽管近些年来PCOS的病因机制探讨较多，但由于其病因复杂多样，截止目前其发病机制仍不明确。<br>　　氨基酸转运载体基因Slc7a5[solutecarrierfamily7，member5]编码的产物为L-型氨基酸转运体1(L-type amino acid transporter 1，LAT1)，其主要功能是转运特定氨基酸，为细胞的生长提供原料。研究表明Slc7a5在癌变的细胞及组织中表达升高，包括乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等，提示其对肿瘤的快速生长和增殖起重要的作用。而且Slc7a5与肥胖，胰岛素抵抗及炎症反应也密切相关。在本课题组的前期研究中，通过转录组测序寻找在来曲唑诱导的大鼠PCOS模型的卵巢上差异表达的基因，首次发现Slc7a5在大鼠PCOS模型的卵巢上高表达,提示Slc7a5可能在PCOS的发生或病情进展中发挥一定的作用,而Slc7a5在卵巢相关功能，如卵泡发育?卵母细胞成熟以及类固醇激素合成中的作用尚无报道。研究目的：<br>　　探究Slc7a5在大鼠PCOS模型卵巢上的表达特点及其在颗粒细胞中的功能，从而研究Slc7a5在PCOS发生及病情进展中可能发挥的作用，为PCOS的诊断及治疗提供新的实验数据和理论参考。<br>　　研究方法及结果：<br>　　1.Slc7a5在大鼠多囊卵巢综合征模型卵巢上的表达<br>　　通过来曲唑连续灌胃23天构建大鼠PCOS模型。结果表明，造模结束后，PCOS组大鼠体重明显高于对照组(P＜0.05)。通过阴道涂片行发情周期鉴定，对照组大鼠发情周期规律；PCOS组大鼠失去正常发情周期，持续处于发情间期。进一步通过ELISA方法测定大鼠血清激素水平。结果显示，与对照组相比，PCOS组大鼠血清中LH、T的浓度升高(P＜0.05)，E2浓度降低(P＜0.05)，FSH及TG的浓度两组之间没有明显差异。对卵巢组织进行HE染色观察卵巢形态改变，结果显示对照组卵巢可见多个黄体和各个发育阶段的卵泡，多层颗粒细胞排列整齐；PCOS组卵巢则呈典型多囊样的病理性改变，出现大量囊状扩张的卵泡，颗粒细胞层明显减少。通过免疫组化检测Slc7a5在卵巢上的表达情况，结果可见，Slc7a5在颗粒细胞、卵泡膜细胞及卵巢间质均有表达，且PCOS组Slc7a5表达水平高于对照组(P＜0.05)。进一步通过荧光定量PCR及Westernblot检测Slc7a5的表达水平。结果表明与对照组相比，PCOS组卵巢组织中Slc7a5mRNA及蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05)。<br>　　2.Slc7a5对大鼠卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响<br>　　分离培养原代大鼠颗粒细胞并转染Slc7a5的小干扰RNA(siRNA)及过表达质粒，从而探究Slc7a5对颗粒细胞类固醇激素合成的影响。通过荧光定量PCR及Westernblot检测类固醇激素合成相关酶Star,Cyp11a1,Hsd3β1基因及蛋白的表达情况。结果表明干扰Slc7a5后，三种酶表达均降低，但只有Cyp11a1表达降低有统计学意义(P＜0.05)；而过表达Slc7a5后，三种酶表达均明显升高(P＜0.05)。进一步用ELISA方法检测颗粒细胞培养上清液中E2及P的水平。结果表明干扰及过表达Slc7a5后并没有改变颗粒细胞培养上清液中E2及P水平(P＞0.05)。为了探究雄激素对颗粒细胞Slc7a5表达的影响，在颗粒细胞的培养基中添加睾酮培养48小时后，通过荧光定量PCR及Westernblot检测Slc7a5的表达水平。结果表明，Slc7a5的表达明显升高(P＜0.05)。<br>　　3.Slc7a5对大鼠卵巢颗粒细胞活力及凋亡的影响及机制<br>　　在显微镜下观察和CCK8试验检测Slc7a5表达改变对颗粒细胞活力的影响。结果表明，干扰Slc7a5后细胞活力没有明显改变(P＞0.05)；而过表达Slc7a5后细胞活力明显降低(P＜0.05)。通过流式细胞术检测对细胞凋亡及细胞周期的影响。结果表明，干扰Slc7a5后颗粒细胞的凋亡率没有明显改变(P＞0.05)；而过表达Slc7a5后颗粒细胞的凋亡率明显增加(P＜0.05)，细胞S期明显缩短(P＜0.05)。为了探究Slc7a5促进颗粒细胞凋亡的相关机制，在过表达Slc7a5后检测了凋亡相关基因和蛋白的表达。结果表明，在颗粒细胞过表达Slc7a5后，凋亡相关基因Tnf-α,Caspase-3及Caspase-8表达明显增加(P＜0.05)；凋亡相关蛋白TNF-α,Caspase-3，Cleaved-Caspase3,Caspase-8及Cleaved-Caspase8的表达也明显增加(P＜0.05)。进一步检测了颗粒细胞过表达Slc7a5后细胞Caspase-3及Caspase-8的活性。结果表明，细胞内Caspase-3及Caspase-8的活性明显增加(P＜0.05)。为了探究Slc7a5是否通过增加颗粒细胞的氧化应激，从而促进细胞凋亡，检测了颗粒细胞过表达Slc7a5后的ROS及超氧化物阴离子水平。结果表明，其ROS及超氧化物阴离子水平明显降低(P＜0.05)。为明晰细胞内ROS及超氧化物阴离子水平降低的机制，检测了抗氧化酶相关基因及蛋白(Sod2,Hmox1,xCT)的表达。结果表明，颗粒细胞过表达Slc7a5后Sod2,Hmox1,xCT表达水平明显升高(P＜0.05)。<br>　　4.Slc7a5下游基因的筛选及其在颗粒细胞中的功能研究<br>　　为了进一步探究Slc7a5在颗粒细胞中的作用机制，本研究在颗粒细胞上过表达SLC7A5后行转录组测序。通过测序发现颗粒细胞过表达Slc7a5后共有1943个差异表达的基因，其中上调998个，下调945个。通过KEGG及GO富集分析发现差异基因主要与癌症相关通路，TNF信号通路，细胞增殖，蛋白质结合及炎症反应等通路相关。通过转录组测序及进一步的验证，选定Mgst3作为Slc7a5的下游靶基因。本试验研究发现颗粒细胞过表达Slc7a5后，Mgst3的表达降低，接下来研究了Mgst3表达降低对颗粒细胞的影响。通过CCK8试验检测颗粒细胞干扰Mgst3后的细胞活力，结果表明，细胞活力明显降低(P＜0.05)。通过流式细胞术检测颗粒细胞干扰Mgst3后的细胞凋亡及细胞周期情况。结果表明，颗粒细胞干扰Mgst3后，细胞的凋亡率增加(P＜0.05)，细胞S期明显缩短(P＜0.05)。为了探究Mgst3促进颗粒细胞凋亡的相关机制，通过荧光定量PCR，Westernblot检测了凋亡相关基因及蛋白的表达。颗粒细胞干扰Mgst3后，凋亡相关基因Tnf-α，Caspase-3及Caspase-8表达量均明显增加(P＜0.05)；凋亡相关蛋白TNF-α,Caspase-3，Cleaved-Caspase3,Caspase-8及Cleaved-Caspase8的表达量也明显增加(P＜0.05)。进一步检测了颗粒细胞干扰Mgst3后细胞Caspase-3及Caspase-8的活性，结果表明，细胞内Caspase-3及Caspase-8的活性明显增加(P＜0.05)。<br>　　研究结论：<br>　　1.在大鼠PCOS模型的卵巢上Slc7a5的表达明显升高。<br>　　2.在细胞水平，睾酮能够促进颗粒细胞Slc7a5的表达。<br>　　3.Slc7a5表达升高能够影响颗粒细胞类固醇激素合成相关酶的表达。<br>　　4.Slc7a5表达升高还能够通过降低Mgst3的表达，降低细胞活力，激活凋亡相关通路，促进颗粒细胞凋亡，从而参与PCOS发生。