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摘要目的：<br>　　肺癌目前是全球发病率和病死率最高的恶性肿瘤，针对早期肺癌的诊断及预后评估显得尤为重要。通过对肺癌差异表达基因的探索疾病发生、发展，肺癌的治疗已从传统的手术治疗、放化疗发展为包括靶向和免疫治疗等综合性治疗，肺癌的治疗将逐渐个体化、精准化。寻找肺癌患者差异性基因的分子靶点具有重要的临床指导作用，本文研究旨在：<br>　　1.基于生物信息学的方法分析非小细胞肺癌(NSCLC)与正常肺组织差异表达的基因，挑选出在NSCLC发生发展过程中的核心基因，探索差异基因的生物学功能，评估其在肺癌治疗中作为分子靶点的可行性。<br>　　2．验证目标基因MKI67在肺癌发生发展中的地位，研究其和NSCLC患者临床病理分期、预后的关系。分析MKI67在NSCLC发生发展的分子机制，探讨其作为生物标志物对NSCLC患者在诊断与评估预后的中的价值，辅助临床手术患者术后辅助治疗方案制定可行性以及为治疗提供新的分子靶点的潜力。<br>　　方法：<br>　　1.NSCLC的生信分析<br>　　(1)差异表达基因筛选及聚类分析<br>　　①从TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas)下载NSCLC基因表达RNA测序(RNAseq)数据集。使用软件R语言(version 4.0.3)及DESeq2软件包对NSCLC与正常肺组织差异表达基因(DEGs)进行筛选。<br>　　②从UCSCXena(https://xenabrowser.net/hub/)(数据基于TCGA数据库)下载NSCLC肺癌样本的RNA-seq的归一化数据和临床数据，并用WGCNA软件包将临床表型相关的模块基因进行聚类分析。<br>　　(2)将聚类分析得到的模块基因对差异基因进行验证并进行功能分析<br>　　①通过WGCNA软件包筛选得到的协同表达的基因网络导入Cytoscape3.7.2中，利用cytohubba插件提取出关键子网络，利用MCC等12种算法，按照权重筛选出其中的hub基因。<br>　　②利用FunRich3.1.3软件，通过基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)、基因本体论(Gene ontology, GO)分析、KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析、蛋白质相互作用(Protein ProteinInteraction, PPI)对其发生发展机制进行探讨。<br>　　③通过Kaplan-Meierplotter数据库(https://kmplot.com/analysis)对部分基因的差异表达进行生存分析<br>　　2.MKI67在NSCLC中表达及临床意义<br>　　通过初步生信分析，验证NSCLC在实际临床应用中常用标志物Ki67的编码基因MKI67的差异表达情况，，并联合临床数据进一步探讨。<br>　　(1)MKI67与临床病理关系<br>　　收集2015年3月-2019年10月就诊于吉林大学中日联谊医院胸外科438名手术患者临床资料。其中男性患者208人，女性患者230人；I期患者368人，II期患者34，III期患者31，IV患者2人。Ki67低表达(≤50%)患者364人，高表达(＞50%)患者74人。利用SPSS软件分析Ki67高表达与患者性别，吸烟指数，肿瘤最大直径，临床分期等临床病理特征关系。<br>　　(2)利用在线数据库对MKI67进行生物信息学分析及验证<br>　　①使用Oncomine数据库分析NSCLC患者癌组织与癌旁组织，不同肿瘤类型中MKI67的表达情况。<br>　　②利用人类蛋白质表达图集(The Human Protein Atlas，HPA)在线数据库，分析MKI67在人体中的生物学功能、表达水平及分布。<br>　　③通过Kaplan-Meierplotter在线数据库进行对NSCLC不同病理类型分别进行生存分析,评估MKI67作为NSCLC潜在的预后生物标志物、治疗靶基因的临床价值。<br>　　结果：<br>　　1.NSCLC预后相关基因生物信息学分析<br>　　(1)NSCLC与正常肺组织差异表达基因的筛选<br>　　从TCGA数据库中的NSCLC的1146个样本中，我们通过差异分析筛选出以NEK2、KIF4A、CDC20、TYMS、TEK、TOP2A、EXO1等为显著差异的上调基因3631个，以TEK、RTKN2、RAMP2、ACVRL1、EMP2、SEMA3G等为显著差异的下调基因1944个。通过WGCNA聚类分析得到与周围基因高度相关性的中枢基因CDCA5、KIF2C、MYBL2、TPX2、KIF4A、CDC45、CENPA、DEPDC1、CCNB2等。<br>　　(2)核心基因的确定和功能分析<br>　　利用Cytoscape3.7.2中的cytohubba插件分析共同差异表达基因的网络，利用MCC等12总算法筛选出处于网络中的核心基因，包括NEK2、KIF4A、TEK、TOP2A等。主要富集在信号通讯、细胞生长及维持、信号传导、免疫应答。且多数上调基因的高表达意味着患者更差的临床预后。<br>　　2.MKI67在NSCLC组织中的表达及临床意义<br>　　通过上述生信分析，明确MKI67基因在肺癌组织中与正常组织表达具有明显差异，得到其相关基因表达网络。利用本地NSCLC患者临床资料及在线数据库进行其临床意义分析。<br>　　(1)MKI67与临床病理关系<br>　　分析本地NSCLC患者临床病理资料，MKI67编码产物Ki67的表达程度与NSCLC患者性别(P=0.000051)、病理分期(P=0.02)、肿瘤最大直径(P=0.000156)、淋巴结转移(P=0.024)、BMI(P=0.011)有关，与远处转移(P=0.165)及吸烟指数无关。<br>　　(2)利用在线数据库对MKI67进行生物信息学分析及验证<br>　　①利用Oncomine在线数据库分析Ki67编码基因MKI67在人体不同系统肿瘤中的表达程度，数据提示MKI67在人体内多个器官脏器肿瘤的发生发展过程中是表达增高，除肺癌外，膀胱癌、中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肝癌、肾癌等多种恶性肿瘤中。此外，MKI67的表达在肺癌的不同亚型中，与癌旁组织的对比也显示一致性升高。<br>　　②登入HPA数据库进行分析，MKI67定位于人类基因组10q25，针对编码细胞核有关抗原Ki67进行分析，其对应为大分子蛋白质核抗原，主要分布在增殖细胞内部，分别由分子量345kD和395kD的2条多肽链构成，出现在G1后期，从S期与G2期的变化情况来看持续升高，M期对应为高峰，有丝分裂完成以后开始降解，G0期不再表达，单克隆抗体Ki67只能识别存在于增殖细胞中的核抗原。因此，Ki67通常用作评价细胞增殖程度的生物标志物。目前认为，Ki67表达阳性率越高，增殖活性越大。<br>　　③利用Kaplan-Meierplotter数据库进行NSCLC不同病理类型的在线生存分析,结果显示MKI67高表达的腺癌患者生存率明显降低，而与鳞癌患者远期生存无明显相关，其作为NSCLC潜在的预后生物标志物、治疗靶基因的具有一定临床价值。<br>　　结论：<br>　　(1)基于生物信息学分析方法，本研究筛选了NEK2、KIF4A、CDC20、TYMS、TEK、TOP2A、EXO1等多个核心基因对NSCLC预后具有提示作用及治疗潜力的生物标志物。<br>　　(2)对目的基因MKI67进行探讨，其在多种恶行肿瘤中高表达。Ki67作为临床病理诊断常用指标，是由MKI67基因编码的蛋白质，在细胞周期中起到重要作用，可作为生物标志物评估细胞增殖量化指标。Ki67表达阳性率越高，增殖活性越大，MKI67可作为辅助判断肺腺癌潜在的预后生物标志物、治疗靶基因的具有临床价值。