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摘要研究目的:<br>　　口腔鳞状细胞癌是一种具有破坏性和致死性的恶性肿瘤，易发生局部复发和远处转移，而侵袭和远处转移是其致死的主要原因，但是目前尚未完全阐明口腔鳞癌侵袭转移的具体机制，所以患者5年生存率未有明显改变[1,2]。口腔鳞状细胞癌与肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)的交互作用在口腔鳞癌的侵袭转移中发挥重要作用，而肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境中主要的免疫细胞，主要划分为M1和M2两种表型，尤其是M2型肿瘤相关巨噬细胞可通过分泌多种细胞因子促进肿瘤的侵袭转移[3,4]。研究发现HSP27在口腔鳞癌中高表达，且与患者的不良预后密切相关[5]，表明HSP27可能在口腔鳞癌的进展中发挥作用。研究表明HSP27可作为分泌性蛋白调控免疫细胞，促进肿瘤的进展[6]。因此，本研究的目的是通过检测HSP27在CAL27细胞中的表达情况，进一步探讨HSP27是否通过调控肿瘤相关巨噬细胞的极化状态及IL-6的分泌水平，进而影响CAL27细胞的上皮间充质转化和侵袭转移，同时探讨IL-6在CAL27细胞发生EMT中的作用及相关机制，阐明肿瘤相关巨噬细胞在口腔鳞状细胞癌的病理过程中扮演的角色，为以其为靶标提供理论依据。<br>　　研究方法:<br>　　以永生化人正常表皮细胞Hacat、口腔鳞状细胞肿瘤细胞CAL27和小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，用HSP27小干扰RNA、外源性rhHSP27、外源性rhIL-6、TLR4受体抑制剂TAK-242、IL-6受体抑制剂进行干预。免疫荧光法检测rhHSP27和TLR4共定位情况；实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR， qRT-PCR)检测HSP27、M1和M2型TAMs相关细胞因子(CD163、Arg-1、TNF-α、IL-10、iNOS、IL-12、IL-6)、EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的mRNA表达水平；WesternBlot法检测HSP27及EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin)的蛋白表达水平；ELISA法检测IL-6的分泌水平；细胞划痕实验和Transwell实验检测CAL27细胞的迁移和侵袭情况。<br>　　研究结果:<br>　　1.与人正常表皮细胞Hacat和TAMs上清液干预的Hacat相比，TAMs上清液干预的CAL27细胞中HSP27的mRNA表达显著升高，并且与RAW264.7和TAMs相比，HSP27主要由CAL27细胞表达。<br>　　2.HSP27小干扰RNA敲低CAL27细胞中HSP27的表达后，用对应上清液干预RAW264.7细胞后，结果发现：干扰组TAMs下调Arg-1、IL-10及IL-6的mRNA表达，而上调M1型TAMs细胞因子iNOS、IL-12、TNF-αmRNA表达水平，这表明敲低HSP27后抑制TAMs向M2型TAMs转化。<br>　　3.加入CAL27上清液稀释的rhHSP27作用于RAW264.7后，qRT-PCR结果显示M2型TAMs相关细胞因子(Arg-1、CD163)及IL-6的mRNA表达水平升高，而M1型TAMs相关细胞因子(iNOS、IL-12)mRNA表达水平下降，而提前用CAL27上清液稀释的TAK-242抑制TLR4受体后，再加入rhHSP27后，结果表明Arg-1和IL-6的mRNA表达水平降低，而IL-12表达水平升高。ELISA结果表明，加入外源性rhHSP27干预RAW264.7后，促进IL-6的分泌水平，而提前加入TAK-242后，明显抑制了IL-6的分泌。<br>　　4.CAL27上清液稀释的rhHSP27或者同时稀释TAK-242和rhHSP27共同干预RAW264.7细胞12h后，更换新培养基继续孵育24h后，收集相应TAMs上清液作用于CAL27细胞24h或者48h。结果表明，加入rhHSP27干预的RAW264.7细胞产生的TAMs上清液使划痕面积显著缩小，说明rhHSP27促进了CAL27细胞迁移能力，而加入TAK-242干预后，抑制了CAL27细胞迁移能力。用上述方法诱导RAW264.7转化为TAMs后，Transwell实验共培养CAL27细胞与TAMs，结果表明，与对照组相比，加入rhHSP27诱导的TAMs，CAL27细胞迁移和侵袭细胞数显著增多，明显促进了CAL27细胞迁移和侵袭能力；而加入TAK-242干预后转化的TAMs降低了CAL27细胞迁移和侵袭细胞数，抑制了CAL27细胞迁移和侵袭能力。<br>　　5.与4相同方法取得相应TAMs上清液作用于CAL27细胞，qRT-PCR结果显示，HSP27组CAL27细胞N-cadherin和Vimentin的表达水平升高，而加入TAK-242抑制剂后，Vimentin的表达水平降低。WesternBlot结果表明，与对照组相比，HSP27组N-cadherin的表达水平升高，而TAK-242组N-cadherin的表达水平降低。<br>　　6.Transwell共培养CAL27细胞和TAMs之前，上室肿瘤细胞提前加入IL-6受体抑制剂干预24h，下室RAW264.7细胞用外源性HSP27进行干预。实验结果表明，与对照组相比，抑制剂组CAL27细胞迁移和侵袭细胞数明显减少，说明IL-6可促进CAL27细胞的迁移和侵袭。<br>　　7.用小干扰RNA敲低CAL27细胞中HSP27的表达后，加入外源性rhIL-6，qRT-PCR结果表明，与对照组相比，HSP27-siRNA组CAL27细胞E-cadherin表达升高，N-cadherin的表达降低；WesternBlot实验结果表明，与对照组相比，HSP27-siRNA组N-cadherin的表达水平降低。<br>　　研究结论:<br>　　1.HSP27在CAL27细胞中高表达；<br>　　2.HSP27-TLR4轴诱导TAMs的M2表型极化和IL-6的分泌；<br>　　3.HSP27-TLR4轴通过TAMs进而促进CAL27细胞侵袭转移和EMT；<br>　　4.IL-6/IL-6R促进CAL27细胞的侵袭转移；<br>　　5.IL-6通过CAL27细胞表达的HSP27促进EMT。