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HSP27对肿瘤相关巨噬细胞M2极化及其IL-6分泌的调控在口腔鳞癌侵袭转移中的研究

摘要研究目的:<br>  口腔鳞状细胞癌是一种具有破坏性和致死性的恶性肿瘤,易发生局部复发和远处转移,而侵袭和远处转移是其致死的主要原因,但是目前尚未完全阐明口腔鳞癌侵袭转移的具体机制,所以患者5年生存率未有明显改变[1,2]。口腔鳞状细胞癌与肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages,TAMs)的交互作用在口腔鳞癌的侵袭转移中发挥重要作用,而肿瘤相关巨噬细胞作为肿瘤微环境中主要的免疫细胞,主要划分为M1和M2两种表型,尤其是M2型肿瘤相关巨噬细胞可通过分泌多种细胞因子促进肿瘤的侵袭转移[3,4]。研究发现HSP27在口腔鳞癌中高表达,且与患者的不良预后密切相关[5],表明HSP27可能在口腔鳞癌的进展中发挥作用。研究表明HSP27可作为分泌性蛋白调控免疫细胞,促进肿瘤的进展[6]。因此,本研究的目的是通过检测HSP27在CAL27细胞中的表达情况,进一步探讨HSP27是否通过调控肿瘤相关巨噬细胞的极化状态及IL-6的分泌水平,进而影响CAL27细胞的上皮间充质转化和侵袭转移,同时探讨IL-6在CAL27细胞发生EMT中的作用及相关机制,阐明肿瘤相关巨噬细胞在口腔鳞状细胞癌的病理过程中扮演的角色,为以其为靶标提供理论依据。<br>  研究方法:<br>  以永生化人正常表皮细胞Hacat、口腔鳞状细胞肿瘤细胞CAL27和小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,用HSP27小干扰RNA、外源性rhHSP27、外源性rhIL-6、TLR4受体抑制剂TAK-242、IL-6受体抑制剂进行干预。免疫荧光法检测rhHSP27和TLR4共定位情况;实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR, qRT-PCR)检测HSP27、M1和M2型TAMs相关细胞因子(CD163、Arg-1、TNF-α、IL-10、iNOS、IL-12、IL-6)、EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的mRNA表达水平;WesternBlot法检测HSP27及EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin)的蛋白表达水平;ELISA法检测IL-6的分泌水平;细胞划痕实验和Transwell实验检测CAL27细胞的迁移和侵袭情况。<br>  研究结果:<br>  1.与人正常表皮细胞Hacat和TAMs上清液干预的Hacat相比,TAMs上清液干预的CAL27细胞中HSP27的mRNA表达显著升高,并且与RAW264.7和TAMs相比,HSP27主要由CAL27细胞表达。<br>  2.HSP27小干扰RNA敲低CAL27细胞中HSP27的表达后,用对应上清液干预RAW264.7细胞后,结果发现:干扰组TAMs下调Arg-1、IL-10及IL-6的mRNA表达,而上调M1型TAMs细胞因子iNOS、IL-12、TNF-αmRNA表达水平,这表明敲低HSP27后抑制TAMs向M2型TAMs转化。<br>  3.加入CAL27上清液稀释的rhHSP27作用于RAW264.7后,qRT-PCR结果显示M2型TAMs相关细胞因子(Arg-1、CD163)及IL-6的mRNA表达水平升高,而M1型TAMs相关细胞因子(iNOS、IL-12)mRNA表达水平下降,而提前用CAL27上清液稀释的TAK-242抑制TLR4受体后,再加入rhHSP27后,结果表明Arg-1和IL-6的mRNA表达水平降低,而IL-12表达水平升高。ELISA结果表明,加入外源性rhHSP27干预RAW264.7后,促进IL-6的分泌水平,而提前加入TAK-242后,明显抑制了IL-6的分泌。<br>  4.CAL27上清液稀释的rhHSP27或者同时稀释TAK-242和rhHSP27共同干预RAW264.7细胞12h后,更换新培养基继续孵育24h后,收集相应TAMs上清液作用于CAL27细胞24h或者48h。结果表明,加入rhHSP27干预的RAW264.7细胞产生的TAMs上清液使划痕面积显著缩小,说明rhHSP27促进了CAL27细胞迁移能力,而加入TAK-242干预后,抑制了CAL27细胞迁移能力。用上述方法诱导RAW264.7转化为TAMs后,Transwell实验共培养CAL27细胞与TAMs,结果表明,与对照组相比,加入rhHSP27诱导的TAMs,CAL27细胞迁移和侵袭细胞数显著增多,明显促进了CAL27细胞迁移和侵袭能力;而加入TAK-242干预后转化的TAMs降低了CAL27细胞迁移和侵袭细胞数,抑制了CAL27细胞迁移和侵袭能力。<br>  5.与4相同方法取得相应TAMs上清液作用于CAL27细胞,qRT-PCR结果显示,HSP27组CAL27细胞N-cadherin和Vimentin的表达水平升高,而加入TAK-242抑制剂后,Vimentin的表达水平降低。WesternBlot结果表明,与对照组相比,HSP27组N-cadherin的表达水平升高,而TAK-242组N-cadherin的表达水平降低。<br>  6.Transwell共培养CAL27细胞和TAMs之前,上室肿瘤细胞提前加入IL-6受体抑制剂干预24h,下室RAW264.7细胞用外源性HSP27进行干预。实验结果表明,与对照组相比,抑制剂组CAL27细胞迁移和侵袭细胞数明显减少,说明IL-6可促进CAL27细胞的迁移和侵袭。<br>  7.用小干扰RNA敲低CAL27细胞中HSP27的表达后,加入外源性rhIL-6,qRT-PCR结果表明,与对照组相比,HSP27-siRNA组CAL27细胞E-cadherin表达升高,N-cadherin的表达降低;WesternBlot实验结果表明,与对照组相比,HSP27-siRNA组N-cadherin的表达水平降低。<br>  研究结论:<br>  1.HSP27在CAL27细胞中高表达;<br>  2.HSP27-TLR4轴诱导TAMs的M2表型极化和IL-6的分泌;<br>  3.HSP27-TLR4轴通过TAMs进而促进CAL27细胞侵袭转移和EMT;<br>  4.IL-6/IL-6R促进CAL27细胞的侵袭转移;<br>  5.IL-6通过CAL27细胞表达的HSP27促进EMT。

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