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摘要根尖周膜是位于根尖部的牙周膜，根管内细菌感染一旦突破根尖孔，会引起根尖周膜、牙骨质和牙槽骨的破坏，形成根尖周病变。常规的根尖周病变多能通过根管治疗、根尖外科手术得到有效治疗，然而对于大面积的根尖周病损常规根尖手术后愈合较慢，根尖周组织多以修复方式、并非再生的方式愈合。引导组织再生术(guided tissue regeneration，GTR)与根尖手术的联合应用有利于根尖周病变的愈合。随着组织工程技术的发展，生长因子及干细胞的应用为根尖周组织再生提供了新的研究思路。牙龈间充质干细胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)作为一种新生的干细胞，由于其具有良好的自我更新、多向分化潜能以及免疫调节能力逐渐受到关注。转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)是一种多功能细胞因子，能够促进多种细胞的增殖，对绝大多数类型的细胞来说，都具有极为明显的促进细胞纤维化的作用。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)是迄今为止已知的最强的骨诱导因子之一，具有最强的成骨诱导能力。然而外源性BMP‐2不稳定，可迅速失去生物活性，为维持骨缺损区充足的BMP‐2，目前临床上BMP‐2的使用是过量的，这不仅大大增加了患者的成本负担，而且导致一系列细胞毒反应和临床并发症，因此，如何提高BMP-2的效率，确保其在骨分化阶段发挥作用，是再生医学的关键。<br>　　目的：<br>　　本研究目的在于通过研究TGF-β1与BMP-2对GMSCs增殖和分化的影响，确定TGF-β1促细胞增殖、迁移的最优浓度、BMP-2促成骨分化的最优浓度，探讨TGF-β1与BMP-2单独或联合应用对GMSCs成骨及成纤维分化的影响，进一步证实GMSCs是根尖周膜再生的潜力细胞，为组织再生的“种子细胞”的选择和GMSCs在组织再生领域的应用提供理论依据。<br>　　方法：<br>　　收集临床下颌第三磨牙黏膜阻生需行拔除术的牙周健康患者(18至25岁)因牙龈修整而切下的小块牙龈组织，通过组织块法结合有限稀释法分离纯化获得人GMSCs，通过流式细胞术检测人GMSCs细胞表面干细胞标志物的表达。通过细胞活力检测试剂盒(cell counting kit 8，CCK8),Transwell实验检测TGF-β1对人GMSCs的最佳作用浓度。通过CCK8，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性测试检测BMP-2对人GMSCs的最佳作用浓度。通过实时定量聚合酶链反应(quantitativereal-timepolymerase chain reaction，qRT-PCR)检测最佳浓度TGF-β1和BMP-2单独或联合应用对成骨、成纤维相关标志物基因表达水平的影响。实验数据采用GraphPadPrism8.0软件包进行单因素方差分析，统计结果以均数(mean)?标准差(standard deviation，SD)表示，P＜0.05具有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.人GMSCs分离培养与干性鉴定：通过组织块法结合有限稀释法与多次传代贴壁培养分离纯化获得人GMSCs，体外培养的原代间充质干细胞呈长梭形，具有成纤维细胞的典型特征。流式细胞仪检测结果表明，人GMSCs表面间充质干细胞表面标记物CD90和CD105表达阳性，而造血干细胞表面标志物CD34和CD45表达为阴性；体外诱导的GMSCs，在特定诱导条件下可以向成脂、成骨方向分化，表明其具有多向分化潜能。<br>　　2.TGF-β1促进人GMSCs的增殖迁移：CCK8结果表明，与空白对照组相比，1ng/mL和5ng/mLTGF-β1对人GMSCs的增殖具有显著的促进效应(1ng/mL，P＜0.01；5ng/mL，P＜0.001)；Transwell实验结果表明，1ng/mlTGF-β1能显著促进人GMSCs的迁移(P＜0.01)。<br>　　3.BMP-2促进人GMSCs的增殖及提升ALP活性：CCK8结果表明，与空白对照组相比，10ng/mLBMP-2能促进人GMSCs的增殖(P＜0.05)；ALP活性测试结果表明，成骨诱导7天，与成骨诱导组相比，10ng/mLBMP-2可显著提升人GMSCs的ALP活性(P＜0.01)。<br>　　4.TGF-β1促进人GMSCs成纤维分化：成纤维诱导7、14或21天，qRT-PCR结果表明1ng/mLTGF-β1能可显著上调成纤维相关标志物Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ，COL1)、Ⅲ型胶原(CollagentypeⅢ，COL3)、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1，FSP-1)、牙周膜相关蛋白-1(periodontal ligament associated protein-1，PLAP-1)和α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smoothmuscleactin，α-SMA)的基因表达水平(P<0.05)。<br>　　5.BMP-2促进人GMSCs成骨分化：成骨诱导7、14或21天，qRT-PCR结果表明10ng/mLBMP-2能显著上调成骨相关标志物ALP、runt相关转录因子2(runt-relatedtranscription factor 2，Runx2)，骨桥蛋白(Osteopontin，OPN),COL1的基因表达水平(P＜0.05)?<br>　　6.TGF-β1与BMP-2联合应用与单独应用相比较不能更有效的促进人GMSCs的增殖、成骨、成纤维分化：CCK8结果表明，与空白对照组相比，1ng/mLTGF-β1和10ng/mLBMP-2联合应用对人GMSCs的增殖无显著的促进效应(P＜0.05)；成纤维诱导7天、14天、21天，qRT-PCR结果显示1ng/mLTGF-β1和10ng/mLBMP-2联合应用与1ng/mLTGF-β1单独应用无统计学差异(P＞0.05);成骨诱导7天、14天、21天，qRT-PCR结果显示1ng/mLTGF-β1和10ng/mLBMP-2联合应用与10ng/mLBMP-2单独应用无统计学差异(P＞0.05)。<br>　　结论：<br>　　1.1、5ng/mLTGF-β1能促进人GMSCs的增殖，1ng/mLTGF-β1能促进人GMSCs的迁移。<br>　　2.10ng/mLBMP-2能促进人GMSCs的增殖并可显著提升人GMSCs的ALP活性。<br>　　3.1ng/mLTGF-β1应用7、14或21天能显著上调人GMSCs成纤维相关标志物基因表达水平；10ng/mLBMP-2应用7、14或21天能显著上调人GMSCs成骨相关标志物的基因表达水平。<br>　　4.1ng/mLTGF-β1与10ng/mLBMP-2联合应用未显著促进人GMSCs的增殖；1ng/mLTGF-β1与10ng/mLBMP-2联合应用效果与单一因子单独应用无显著差异。