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毛头鬼伞菌丝体多糖的结构特征及其对糖尿病肾损伤修复的相关机制初探

摘要毛头鬼伞(Coprinus comatus)富含多种营养物质,同时兼有较高的药用价值,其主要生理活性成分是毛头鬼伞多糖,但目前的研究多集中在子实体多糖,而对菌丝体多糖的结构特征、降血糖活性、糖尿病肾损伤修复及其机制等方面研究甚少。<br>  本课题首先对毛头鬼伞菌丝体粗多糖(Crude C. comatus mycelia polysaccharides, C-CMP)进行了分离纯化,获得了2种组分CMP和N-CMP;其次通过体外抗氧化及模拟消化试验,筛选了进入体内发挥效应的多糖组分(CMP);之后对CMP进行了结构表征并分析了其体外降糖潜力,探讨其发挥生物效应的构效联系;最后,用CMP干预治疗糖尿病小鼠,研究了其对糖尿病小鼠的降血糖、降血脂、改善能量代谢紊乱以及对高血糖引起的肾损伤的修复作用与潜在机理,为治疗和预防糖尿病及其并发症的药物开发提供线索,同时也为食用菌资源的深度开发与利用提供借鉴。主要结果如下:<br>  (1)采用液体深层发酵技术获得毛头鬼伞菌丝体,生物量为2.23±0.43g/L;对菌丝体进行脱脂、热水抽提得到粗多糖C-CMP,经DEAE-52纤维素阴离子交换柱分离纯化得到2个组分,分别命名为CMP和N-CMP,其中CMP与N-CMP的得率分别占C-CMP的29.4%和15.8%。凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography,GPC)分析表明CMP与N-CMP的重均分子量大小分别为495.86kDa和1.12kDa。<br>  (2)体外抗氧化试验表明,组分CMP对羟基及DPPH自由基的半数清除浓度IC50分别达到0.98mg/mL和1.09mg/mL,显著优于组分N-CMP。体外消化试验结果发现,在经过模拟口腔、胃部、小肠的三级消化之后,组分CMP所受影响较小,其分子量从491.48kDa降至423.09kDa,还原糖含量由0.395mg/g增加至0.877mg/g;但N-CMP在三级消化过程中不能稳定存在,其重均分子量由1.120kDa降至171Da,接近单糖水平,而还原糖含量由0.449mg/g增加至2.480mg/g,表明组分CMP具备更强的稳定性,具备进入体内发挥生物效应的潜能。<br>  (3)离子色谱法(Ion chromatography,IC)测定结果显示组分CMP由岩藻糖,核糖,阿拉伯糖,木糖,甘露糖,半乳糖和葡萄糖组成,其中半乳糖占比最高,可能是多糖糖链中的主要成分;甲基化及红外(FT-IR)测定结果表明CMP中糖苷键类型主要包括→6)-Galp-(1→,→2,6)→Manp(1→,-Galp-(1→,三者占比合计超过78%,且主链中存在α型糖苷键及吡喃型糖环;原子力电子显微镜(Atomicforcemicroscope,AFM)扫描结果显示CMP以多分支网状结构存在于溶液之中,其主链长度介于50-200nm之间,单链厚度在2-6nm左右,宽度为16nm左右。<br>  (4)采用体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶试验评价了组分CMP的体外降糖能力。结果发现,CMP对上述2种酶的活性均存在显著抑制,CMP对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值分别达到6.84mg/mL和2.26mg/mL,经双倒数作图法绘制Lineweaver-Burk曲线进行分析发现,CMP对2种葡萄糖代谢酶的抑制类型均属于可逆性抑制中的混合型抑制,表明CMP具备降糖活性,具备进一步研究的价值。<br>  (5)采用高脂饮食合并链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)注射构建糖尿病小鼠,经CMP连续60d的干预之后,结果表明CMP可显著改善糖尿病肾病小鼠的胰岛素抵抗和能量代谢,抑制肾功能障碍,减轻肾脏氧化应激和炎症反应,修复肾脏足细胞损伤,延缓肾纤维化过程。具体表现为:①CMP可以降低糖尿病肾病小鼠体内空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG)、空腹胰岛素(Fasting insulin,FINS)、糖化血红蛋白(Glycated serum protein,GSP)和胰岛素稳态指数(Homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)水平,从而改善胰岛素抵抗症状。②CMP可以减少血清中总胆固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triacyl glycerols,TG)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量,减少血脂的积累,发挥降血脂效应。③CMP可以上调能量代谢中枢因子腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosinemonophosphateactivatedproteinkinaseα,AMPKα)的磷酸化水平,降低血清中瘦素(Leptin,LEP)的含量,增加脂连素(Adiponectin, ADPN )水平,从而纠正糖尿病小鼠体内存在的能量代谢紊乱。④CMP可以通过Nrf2/Keap1途径上调超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase , SOD )、过氧化氢酶(Catalase,CAT)谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的mRNA表达量,增强内源性抗氧化酶活性,降低脂质代谢物水平,减轻活性氧(Reactive oxygen species,ROS)对肾脏造成的损伤。⑤CMP能够抑制TLR4/NF-?B信号通路的活化,降低肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白介素1?(Interleukin 1?,IL-1?)和白介素6(Interleukin 6,IL-6)的释放,改善肾脏中的炎性应激状况。⑥CMP还能够以剂量依赖性的方式促进PTEN蛋白的表达,负性调控PI3K/AKT信号通路,同时也可以降低Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin在细胞质中的积累,减轻高糖环境对肾足细胞造成的损伤。⑦CMP通过抑制TGF-β1/Samd3信号通路的转导,降低纤维化相关因子如胱抑素C(Cystatin C,CysC)、转化生长因子?1(Transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)和金属蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitors of metalloproteinase 1,TIMP-1)的释放,进而阻止或逆转肾脏的纤维化进程。<br>  综上所述,CMP作为一种优良的天然降糖物质具备进一步开发成为糖尿病肾病预防及治疗药物的潜能。

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