摘要目的:探讨淫羊藿苷(ICA)对阿尔茨海默病(AD)小鼠β-淀粉样前体蛋白(APP)泛素化修饰的影响。<br> 方法:细胞实验,采用过表达人APP695的HEK293细胞(OE-APP)以及正常的HEK293细胞(空白)进行研究,分为6个小实验:①分组:空白组、ICA(10、20、40、60、80、100μM)组;处理:根据分组处理结束后,MTT法检测细胞活力。②分组:空白组+蛋白合成抑制剂CHX50μg/mL(0、0.5、1、2、3、4h)、ICA(60μM)+CHX;处理:采用CHX处理不同时间点后,Westernblot检测APP的蛋白水平。③分组:空白组、ICA(60μM)组、蛋白酶体抑制剂MG132(20μM)组、ICA(60μM)+MG132(20μM)组;处理:采用APP抗体进行免疫共沉淀(Co-IP),Westernblot检测泛素(Ub)、UbK48、UbK63、APP、HRD1蛋白水平。④分组:空白组、空白+ICA(60μM)组、OE-APP组、OE-APP+ICA(60μM)组;处理:Westernblot检测ICA对HRD1蛋白表达的影响。⑤分组:Control-siRNA组、HRD1-siRNA(60、70、80nM)组、Control-siRNA组、Control-siRNA+ICA(60μM)组、HRD1-siRNA(80nM)、HRD1-siRNA(80nM)+ICA(60μM)组;处理:Westernblot检测HRD1的沉默效率,以及转染HRD1-siRNA后,Westernblot检测Ub、UbK48、UbK63、APP、HRD1蛋白水平。⑥分组:空白组、空白+ICA(60μM)组;处理:免疫荧光检测APP与早期、晚期内体标志物(EEA1、LAMP2)的共定位。<br> 动物实验中,雄性APP/PS1转基因小鼠和野生型(WT)小鼠随机分成5个组:WT对照组(n=10)、WT+ICA60mg/kg给药组(n=10)、APP/PS1对照组(n=10)、APP/PS1+ICA60mg/kg给药组(n=10)、APP/PS1+多奈哌齐(DPZ)1mg/kg给药组(n=8),给药组自6月龄起灌胃ICA或DPZ,对照组小鼠给予等量蒸馏水,每天1次,连续灌胃给药3个月后,Morris水迷宫和Y迷宫实验检测小鼠空间学习记忆功能的改变;之后收集脑组织,提取总蛋白质,APP抗体进行免疫共沉淀(Co-IP),Westernblot检测Ub、UbK48、UbK63、APP、HRD1蛋白水平;免疫荧光检测APP与早期、晚期内体标志物(EEA1、LAMP2)的共定位。<br> 结果:细胞实验研究表明:ICA浓度不超过80μM不影响细胞活力;ICA可以促进APP蛋白的降解,这一结果与ICA增加APP的泛素化水平有关,特别是总泛素化和UbK48连接的APP泛素化水平;另外,ICA可促进HRD1蛋白的表达;80nMHRD1-siRNA可使HRD1蛋白水平降低至73%,沉默HRD1以后,APP的UbK48、UbK63和总泛素化修饰水平均明显降低;此外,ICA可降低EEA1和APP的共定位,而ICA对LAMP2和APP的共定位几乎没有影响。动物实验结果表明:ICA可明显改善小鼠空间学习和记忆功能,以及ICA可刺激AD模式小鼠脑内UbK48连接的APP泛素化,而对UbK63连接的APP泛素化作用较小;另外,ICA可降低AD模型小鼠脑内EEA1和APP的共定位,而ICA对LAMP2和APP的共定位几乎没有影响。这一结果与细胞实验结果一致。<br> 结论:ICA通过上调HRD1蛋白表达增加APP泛素化修饰,促进蛋白酶体依赖的APP蛋白降解,从而改善AD小鼠的空间学习记忆功能。
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