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摘要研究背景<br>　　缺氧缺血性脑病（Hypoxic-ischemicencephalopathy，HIE）是胎儿围产期因各种因素所致的脑缺氧或缺血而引起的常见新生儿脑损伤性疾病，其中宫内感染（临床绒毛膜羊膜炎等）引起母体产前免疫激活反应（maternalimmuneactivation，MIA）导致的出生新生儿脑损伤是较为常见缺血缺氧损伤原因之一。目前对于MIA相关HIE的治疗，包括亚低温治疗和康复治疗，只在一定程度上缓解症状，但并不能逆转神经系统后遗症的发生。由于MIA导致的缺血缺氧损伤的机制复杂、危害持久，急需更深入地了解机制研究来探索更加有效的治疗方法。<br>　　脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）孕鼠腹腔注射预处理是常见的幼鼠MIA相关缺血缺氧性脑病的造模方法，相较于单侧颈总（内）动脉结扎及孕鼠子宫临产摘除，拥有易操作、幼鼠模型无创伤的独特优势。通过脂多糖（LPS）孕鼠腹腔注射构建具有MIA-HIE损伤后幼鼠脑病理形态和行为学异常的幼鼠模型，进一步研究MIA导致的脑损伤机制，同时为今后探索治疗缺氧缺血性脑病的新方法打下基础。<br>　　近年来国内外临床研究显示干细胞可能是治疗HIE的有效手段。干细胞有多种来源，其中脐带间充质干细胞（umbilicalcordmesenchymalstemcells，UC-MSCs）相比于其他成体干细胞，具有较强的分化能力和较低的免疫原性。由于干细胞具有自我增殖和特异性分化修复受损组织的能力，脐带间充质干细胞有望通过对损伤神经组织进行修复，给缺氧缺血性脑病患儿带来康复希望，然而干细胞的治疗机制、如何给药、给药剂量、安全性以及疗效评估等问题仍需进一步研究。<br>　　本研究旨在通过构建脑损伤鼠模型模拟缺氧缺血性脑病患儿的发病机制，探讨鼻腔给药方式移植人脐带间充质干细胞是否可以作用于损伤脑组织，从而从机制上评价人源脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs）对HIE的治疗效果。<br>　　材料与方法<br>　　1、MIA-HIE脑损伤模型鼠的构建。孕中期（孕期第16天）的SD孕鼠，LPS组腹腔内注射LPS溶液(0.5mg/kg)。对照组同时腹腔内注射等量PBS溶液。相同条件饲养待出生后获取幼鼠。对幼鼠进行分组。对照组：母鼠腹腔注射PBS溶液的幼鼠；LPS+PBS组：母鼠腹腔注射LPS溶液，出生后14天幼鼠鼻腔给予10μlPBS；LPS+UC-MSC组：母鼠腹腔注射LPS溶液，幼鼠鼻腔给予10μlUC-MSCs（1×106个/kg）。通过苏木精—伊红染色及尼氏染色观察幼鼠脑形态学改变。通过立耳、翻正反射、悬崖规避、负向地性、门齿发生、听觉惊愕及睁眼测试等发育指标评分对幼鼠进行定期生长发育检测。通过旷场实验、平衡木测试及水迷宫测试对幼鼠进行行为学检测。通过免疫组化检测幼鼠脑内GFAP（+）星形胶质细胞激活情况。<br>　　2、UC-MSCs原代提取和传代培养。通过流式细胞检测对UC-MSCs进行鉴定。CCK-8法检测UC-MSCs的增殖情况。免疫荧光检测UC-MSCs的干性。用特殊条件培养基培养UC-MSCs，检测UC-MSCs的分化能力。<br>　　3、利用尼氏染色和免疫荧光染色观察MIA-HIE脑损伤后及UC-MSCs治疗后神经元的形态学改变和GFAP、IL-6、IL-1β的表达变化。利用免疫组化染色观察脑损伤后PTBP-1的表达及UC-MSCs对PTBP-1表达的调控情况。利用免疫荧光共定位染色观察PTBP-1和GFAP的相关性。利用Westernblot检测评价PTBP-1蛋白对神经元再生的调控。<br>　　结果<br>　　1、孕鼠LPS腹腔注射引起出生后幼鼠脑形态学改变。HE染色示LPS组幼鼠脑皮质神经细胞核仁不明显，排列松散失去层次感；海马细胞数目显著减少且排列松散，呈现“空泡”样。尼式染色示LPS组幼鼠脑皮层神经元较对照组数目减少，结构松散。相较于对照组，LPS组幼鼠脑皮层及海马部位GFAP蛋白表达水平升高。<br>　　2、孕鼠LPS腹腔注射引起出生后幼鼠生长发育和行为学检测结果异常。在睁眼测试中，对照组所需天数比LPS组长（plt;0.05）。LPS组与对照组在出生第1天及第10天的幼鼠平均脑重占体重百分比间存在显著性差异（plt;0.05）。LPS组雄性幼鼠在旷场中静止时间明显高于对照组（plt;0.01）。LPS组的平衡木评分在4天测试中均高于对照组，且在第3-4天的评分相较于对照组存在显著性差异（p＜0.05）。LPS组新生鼠训练第1-3天正确找到平台所用的时间要比对照组更长，训练第1-4天的运动总路程也高于对照组。<br>　　3、UC-MSCs鼻腔给药治疗缓解MIA损伤后神经元的形态学改变。在UC-MSC治疗组中，皮质和海马神经元损伤得到缓解。皮质和海马中的神经元数目增加并显著着色，海马DG区神经元肿胀和空泡较LPS组缓解。<br>　　4、UC-MSCs鼻腔给药治疗抑制MIA损伤后GFAP的过表达。皮层及海马区分别观察发现，LPS+PBS组和LPS+UC-MSC组MIA损伤后，GFAP蛋白高表达，LPS+UC-MSC组GFAP（+）星形胶质细胞数目较LPS+PBS组减少。<br>　　5、UC-MSCs鼻腔给药治疗抑制MIA损伤后炎性因子的表达。将相同时段幼鼠LPS+PBS组和LPS+UC-MSC组比较，LPS+PBS组在皮层部位IL-6呈现高水平表达，海马部位两组IL-6的表达差异不显著。皮层部位两组IL-1β的表达差异不显著，而在海马部位LPS+UC-MSC组IL-1β表达减弱。<br>　　6、UC-MSCs鼻腔给药治疗抑制MIA损伤后PTBP-1蛋白的高表达。皮层区域LPS+PBS组PTBP-1蛋白的表达水平较对照组升高，经UC-MSCs鼻腔给药治疗后，LPS+UC-MSC组PTBP-1蛋白的表达水平较LPS+PBS组降低。LPS+PBS组在海马CA1区PTBP-1的表达情况较对照组和LPS+UC-MSC组升高。对照组、LPS+PBS组和LPS+UC-MSC组在海马CA3区和DG区的未见明显差异。<br>　　7.PTBP-1影响GFAP（+）星形胶质细胞的过度活化及参与调控神经元的再生。LPS+PSB组的GFAP（+）细胞计数高于对照组（*p=0.034lt;0.05）和LPS+MSCs组（**p=0.003lt;0.01）。LPS+PSB组的PTBP-1（+）/GFAP（+）细胞计数高于对照组（*p=0.011lt;0.05）和LPS+MSCs组（**p=0.007lt;0.01）。LPS+PBS组的皮质中GFAP和PTBP-1蛋白的表达水平显着增加（*plt;0.05）。LPS+PBS和LPS+UC-MSC组海马中GFAP（**p＜0.01）和PTBP-1（*p＜0.05）的表达水平呈增长趋势。在LPS+UC-MSC组中，受损区域的PTBP-1蛋白表达明显低于LPS+PBS组（*plt;0.05）。<br>　　结论<br>　　LPS孕中期母鼠腹腔注射法可成功构建MIA-HIE幼鼠脑损伤模型。MIA-HIE损伤后幼鼠在脑皮层和海马区域存在神经元缺失等病理表现并诱发GFAP（+）星形胶质细胞反应性增殖，从而影响幼鼠的运动、探索、协调和学习记忆能力。PTBP-1参与调控LPS诱导的MIA，导致新生儿缺血缺氧性脑损伤。UC-MSCs鼻腔给药治疗可通过抑制PTBP-1的表达、减轻脑部的炎症损伤及调节GFAP（+）星形胶质细胞的数量和功能，来促进神经元的塑性再生并改善脑功能。