HRD1通过泛素化CPT2抑制三阴性乳腺癌脂肪酸氧化和肿瘤发生的机制研究-论文-万方医学网

HRD1通过泛素化CPT2抑制三阴性乳腺癌脂肪酸氧化和肿瘤发生的机制研究

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摘要一、研究背景 　　三阴性乳腺癌是一种异质性极高的乳腺癌亚型，占所有乳腺癌患者的15-20%，该类型乳腺癌主要表现为雌激素受体阴性、孕激素受体阴性和HER-2基因扩增缺失。由于无法从内分泌治疗和抗HER-2靶向治疗中获益，手术和化疗仍然是该类型乳腺癌的主要治疗手段。虽然化疗能够改善TNBC（TriplenegativeBreastCancer，TNBC）患者的预后，但是，化疗耐药、疾病复发和远处转移等问题始终无法解决，因此，寻找新的治疗靶点和预测疗效的标记物对改善三阴性乳腺癌的临床预后迫在眉睫。 　　代谢重编程是肿瘤的重要特征之一，自1924年，OttoWarburg首次报道了肿瘤细胞即使在有氧的条件下依然优先进行糖酵解为肿瘤快速提供ATP和生物大分子，即“Warburg效应”。随后，越来越多的人致力于研究肿瘤中代谢通路的变化，其中糖酵解加速、脂质从头合成上调、谷氨酰胺依赖等被认为是大部分肿瘤共有的代谢特征。与其他大部分肿瘤不同，TNBC具有脂肪酸氧化（FattyAcidOxidation，FAO）加速和谷氨酰胺依赖的代谢表型。然而，随着肿瘤的快速生长，谷氨酰胺的分解代谢加速，耗尽了肿瘤局部谷氨酰胺，导致谷氨酰胺缺乏。研究已经证实谷氨酰胺是肿瘤中消耗最严重的代谢物之一。但是，局部谷氨酰胺缺乏并不足以抑制癌症的发展，其中一个原因是肿瘤细胞可以通过代谢重编程利用替代能源，如脂肪酸，促使肿瘤细胞能够在缺乏营养的微环境中继续生存和保持快速增殖[1-3]。然而在TNBC中FAO如何加速，特别是谷氨酰胺缺乏是否是FAO上调机制的驱动因素之一，仍不清楚。 　　HMG-CoA还原酶降解蛋白1（HMG-CoAReductaseDegradation1，HRD1）作为E3泛素连接酶能够通过降解错误折叠或者未折叠蛋白参与内质网相关降解途径。随着一系列新的底物蛋白的发现，HRD1被证明还可以参与内质网相关降解途径以外的细胞调节过程。近年来，研究证实HRD1在脂质代谢中发挥重要作用。肝脏中HRD1缺失对高脂饮食诱导的肥胖、高脂血症、非酒精性脂肪肝病和胰岛素抵抗具有保护作用。HRD1还参与VAMP3（VesicleAssociatedMembraneProtein3，VAMP3）泛素化，以降低长链脂肪酸摄取。此外，HRD1通过结合和促进LOX1泛素降解参与低密度脂蛋白的调节。 　　在本研究中，我们证明了HRD1在TNBC组织中下调，敲低HRD1能够促进三阴性乳腺癌肿瘤发生；HRD1能够通过泛素化降解CPT2抑制TNBC的脂肪酸氧化，进而抑制TNBC肿瘤发生；我们也发现谷氨酰胺酶抑制剂CB-839对HRD1高表达的TNBC细胞抑制作用更显著。 　　二、研究方法 　　1.收集2019年1月1日至2019年6月1日间于大连医科大学附属第一医院乳腺外科手术并经病理检查确诊为TNBC的10例配对的新鲜癌和癌旁组织，采用WesternBlot方法检测HRD1在TNBC癌组织与癌旁组织蛋白水平表达差异。，， 　　2.采用慢病毒转染技术构建敲低HRD1和HRD1、CPT2双敲低的TNBC细胞系。 　　3.采用CCK-8实验、平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验以及裸鼠皮下成瘤实验检测敲低HRD1对MDA-MB-231细胞增殖、克隆形成和肿瘤发生的影响。 　　4.采用免疫共沉淀和Pulldown实验证实HRD1与CPT2之间的蛋白质相互作用。 　　5.采用WesternBlot方法检测HRD1和CPT2相关蛋白的表达及泛素化水平。 　　6.采用基于LC-MS的方法检测敲低HRD1细胞的肉碱、棕榈酸、硬脂酸等脂肪酸相关指标变化。 　　7.采用生物信息学方法分析TCGA数据库中不同分子亚型乳腺癌中的癌和癌旁组织中的HRD1的mRNA表达。 　　8.采用SPSS17.0软件进行统计学分析，灰度分析的数据以平均值±标准差表示。计量资料两组间比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析；资料不服从正态分布的组间比较采用两样本非参数检验。计数资料两组间比较则采用卡方检验。单因素生存分析采用Kaplan-Meier方法，log-rank检验计算P值，以plt;0.05为差异有统计学意义。 　　三、研究结果 　　（一）HRD1在TNBC中的表达及功能研究 　　1.HRD1在TNBC中呈现低表达。 　　1）通过分析TCGA乳腺癌数据库，HRD1的mRNA水平在TNBC中最低，且癌组织低于癌旁组织。 　　2）10例配对的TNBC患者组织免疫印迹结果显示：HRD1蛋白水平在癌组织低于癌旁正常乳腺组织。 　　2.软琼脂克隆实验证实敲低HRD1促进MDA-MB-231三维克隆形成。 　　3.动物实验证实敲低HRD1促进TNBC肿瘤发生。 　　4.正常培养或葡萄糖缺失的培养条件下，敲低HRD1对MDA-MB-231细胞的增殖和平板克隆形成无影响。 　　5.谷氨酰胺剥夺的条件下，敲低HRD1显著促进MDA-MB-231细胞增殖和平板克隆形成。 　　6.谷氨酰胺饥饿时，HRD1的蛋白质水平显著下调。 　　（二）HRD1通过泛素化CPT2抑制TNBC脂肪酸氧化和肿瘤发生的机制研究 　　1.谷氨酰胺饥饿时，MDA-MB-231细胞内C2肉碱/C0肉碱的比值显著增加，即FAO加速；C2肉碱/(C16肉碱+C18:1肉碱)的比率上调，而肉碱(C16肉碱+C18肉碱)/C0肉碱没有显著改变，表明谷氨酰胺剥夺后，MDA-MB-231细胞内CPT2的活性显著上调，而CPT1的活性没有明显改变。 　　2.在谷氨酰胺剥夺条件下，敲低HRD1显著上调肉碱C2肉碱/C0肉碱比值。 　　3.在谷氨酰胺剥夺条件下，敲低HRD1显著下调棕榈酸和硬脂酸含量。 　　4.在谷氨酰胺剥夺条件下，敲低HRD1显著上调肉碱C2肉碱/(C16肉碱+C18:1肉碱)的比率，但不影响肉碱（C16肉碱+C18肉碱）/C0肉碱的比值，这表明在谷氨酰胺剥夺条件下，HRD1敲低导致CPT2的活性显著增加，而不影响CPT1活性。 　　5.敲低HRD1上调CPT2蛋白质水平，而不影响mRNA水平。 　　6.免疫共沉淀和Pulldown实验结果证实在TNBC中，HRD1与CPT2具有蛋白质相互作用。 　　7.敲低HRD1能够延长CPT2的蛋白质半衰期。 　　8.HRD1通过K-48泛素链多聚泛素化CPT2。 　　1）基于稳定敲低HRD1的MDA-MB-231细胞的内源性泛素化实验结果显示，敲低HRD1能够降低CPT2的泛素化水平。 　　2）基于HEK-293T细胞的外源性泛素化实验发现高表达Myc-HRD1能够增加CPT2的K-48泛素链介导的多聚泛素化。 　　9.TMA免疫组化结果显示在TNBC组织中，HRD1与CPT2二者之间蛋白质表达水平呈显著负相关(R=–0.224,P=0.047)。 　　10.敲低HRD1通过CPT2促进TNBC的脂肪酸氧化和细胞增殖。 　　在敲低HRD1的基础上进一步敲低CPT2，由敲低HRD1所介导的体外克隆形成能力增强、体内肿瘤增殖加快和脂肪酸氧化加速均能够被CPT2的缺失逆转。 　　（三）HRD1是谷氨酰胺酶抑制剂潜在的疗效预测指标 　　1.HRD1是谷氨酰胺酶抑制剂（CB-839）潜在的疗效预测标志物。 　　1）CCK-8实验结果显示，与HRD1敲低组相比，CB-839能够显著抑制对照组MDA-MB-231细胞的增殖； 　　2）体内实验结果显示，与HRD1敲低组相比，CB-839能够显著抑制对照组MDA-MB-231细胞的皮下成瘤能力。 　　四、研究结论 　　本研究探讨并验证了一种TNBC细胞中脂代谢的关键调控蛋白HRD1，并发现其是CB-839治疗的潜在疗效预测标志物： 　　（一）HRD1参与调控三阴性乳腺癌的肿瘤发生 　　1.HRD1在TNBC中低表达； 　　2.HRD1抑制TNBC的肿瘤发生； 　　3.在谷氨酰胺剥夺条件下，敲低HRD1能够促进TNBC体外增殖及克隆形成。 　　（二）HRD1通过泛素化CPT2抑制TNBC脂肪酸氧化和肿瘤发生的机制研究 　　1.谷氨酰胺剥夺条件下，敲低HRD1促进TNBC脂肪酸氧化 　　2.HRD1能够结合CPT2并降低CPT2蛋白质稳定性 　　3.HRD1通过K48多聚泛素化CPT2靶向蛋白酶体途径使其降解 　　4.敲低HRD1通过上调CPT2活性来提高谷氨酰胺剥夺后TNBC细胞的FAO水平 　　（三）TNBC中HRD1与谷氨酰胺酶抑制剂疗效的相关性 　　1.HRD1有可能成为谷氨酰胺酶抑制剂CB-839的疗效预测指标，即HRD1高表达的肿瘤对CB-839敏感性更高。