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摘要目的：<br>　　通过构建人神经母细胞瘤细胞（SK-N-SH）氧糖剥夺/复糖复氧损伤（Oxygen-glucose deprivation reoxygenation,OGD/R）模型模拟脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)，检测OGD/R后hsa_circ_0025853及磷酸化线粒体动力相关蛋白1（Dynamin-related protein1，Drp1）的表达，评价hsa_circ_0025853对p-Drp1表达的影响及其在SK-N-SH细胞OGD/R中的作用，探讨hsa_circ_0025853可能的脑缺血再灌注损伤（CIRI）保护机制，为CIRI的临床诊断和治疗提供理论基础依据。<br>　　方法：<br>　　1.实验细胞分组<br>　　体外培养SK-N-SH细胞，待细胞达到对数生长期时，采用随机数字表法将细胞分为4组（n=40）：对照组（C组）、OGD/R组、hsa_circ_0025853过表达组（E组）和hsa_circ_0025853过表达阴性对照组（EV组）。<br>　　2.实验模型建立<br>　　所有实验组细胞在模型制备前均将细胞铺在25cm2细胞培养瓶中，加入含有1%青霉素-链霉素双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，细胞培养箱条件为37℃，5%CO2-95%空气。待培养至对数生长期时，用胰酶消化细胞1min，计数并将细胞均匀铺在六孔板中培养。24h后将DMEM高糖培养液置换为DMEM低糖培养液，然后将六孔板和氧糖剥夺包迅速放入含有指示剂的密封袋中氧糖剥夺16h，随后取出六孔板，重新更换为DMEM高糖培养液，在细胞培养箱中继续培养4h和12h（即复糖复氧4h和12h）。<br>　　3.质粒细胞转染<br>　　从Circinteractome数据库中获得hsa_circ_0025853基因序列，取环化位点两侧共1023bp碱基克隆到pCE-RB-Mam-EGFP载体骨架中，将重组质粒克隆转染至E.coliDH5α宿主菌中扩增（瑞博公司，苏州），扩增质粒引物序列为hsa_circ_0025853：上游引物（F）：5’-GTGAACCCGTGGATGATAAAG-3’，下游引物（R）：5’-GCAGTGACAGCGAGGATAATGG-3’。将细胞以5×105个/孔密度铺于6孔板或以1.5×104个/孔铺于96孔板，培养至70%~90%密度时使用LipofectamineTM3000转染试剂按照说明书指示转染质粒。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察质粒转染效率（＞70%），并采用qPCR检测过表达载体在细胞中的表达水平。<br>　　4.实验检测方法<br>　　4.1实时荧光定量PCR（qPCR）法检测目的基因表达<br>　　于复糖复氧4h和12h时，使用Trizol试剂裂解细胞提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，NanoDrop2000超微量分光光度计检测RNA的浓度及纯度。按照Takara逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。采用TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Pluse)(2×)反应体系进行qPCR反应。反应包括2步：95℃预变性30s，变性5s；60℃延伸30s，40个循环。记录反应得到Ct值，用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。<br>　　4.2免疫印迹（Western blot）法检测p-Drp1蛋白表达<br>　　于复糖复氧4h和12h时，用含有磷酸酶抑制剂的RIPA组织细胞裂解液冰上裂解细胞15min。裂解后在4℃、12000转/min离心10min，吸取上清液。BCA法测定蛋白质浓度，冰浴湿法将蛋白质转膜，抗体包括适当稀释浓度的p-Drp1一抗及含有辣根过氧化物酶标记的二抗，ECL试剂显影检测蛋白。<br>　　4.3CCK8法检测细胞活力<br>　　于各复糖复氧时间点96孔板每组取5孔铺匀细胞，避光每孔加入10μl CCK-8试剂，继续孵育3h后在酶标仪上检测细胞450nm波长处吸光度值。<br>　　4.4流式细胞术检测细胞凋亡率<br>　　于各复糖复氧时间点6孔板每组取5孔，使用Annexin V/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，用不含EDTA的胰酶消化细胞至细胞回缩为圆形时终止消化，收集细胞并用PBS重新悬浮细胞，再依次分别加入5μl膜联蛋白V和碘化丙锭，室温避光条件下反应15min后采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。<br>　　结果：<br>　　1.与C组比较，OGD/R组、EV组和E组复糖复氧后各时间点细胞活力降低，细胞凋亡率升高，Drp1mRNA及p-Drp1蛋白表达上调；OGD/R组和EV组hsa_circ_0025853表达下调，E组hsa_circ_0025853表达上调。2.与OGD/R组和EV组比较，E组复糖复氧后各时间点细胞活力升高，细胞凋亡率降低，hsa_circ_0025853表达上调，p-Drp1蛋白表达下调（P＜0.05），Drp1mRNA表达水平无显著变化。<br>　　结论：<br>　　1.SK-N-SH细胞OGD/R后细胞活力下降，细胞凋亡率增加，hsa_circ_0025853表达下调，Drp1mRNA和p-Drp1蛋白表达上调。2.增加hsa_circ_0025853的表达能够减轻细胞氧糖剥夺/复糖复氧损伤，其机制与下调p-Drp1蛋白表达有关，但不影响Drp1mRNA的表达。