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摘要癌症是一种严重威胁人类生命健康的重大疾病，给患者及其家庭均带来了巨大的负担。目前临床上针对癌症的治疗主要包括手术、化疗、放疗和介入治疗等，但是这些传统治疗手段的效果有限，并且常常造成严重的毒副作用。近年来，肿瘤免疫治疗已经取得了较大的进展，其主要通过缓解肿瘤微环境的免疫抑制现象，激活机体抗肿瘤免疫系统，从而发挥疗效。然而，肿瘤细胞在免疫逃逸的过程中通常表现为低抗原性，使得体内免疫细胞难以识别肿瘤抗原而发挥疗效。因此，在提高肿瘤细胞免疫原性的同时激活体内的免疫细胞，是一种双管齐下的抗肿瘤免疫治疗手段。<br>　　免疫原性细胞死亡（Immunogeniccelldeath,ICD）是指肿瘤细胞在发生凋亡的同时，由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞，暴露大量损伤相关分子模式（Damageassociatedmolecularpatterns,DAMPs），从而刺激树突状细胞（Dendriticcells,DCs）的摄取、成熟及抗原提呈功能，最终触发肿瘤特异性细胞免疫。因此，通过特定的手段诱导肿瘤细胞发生ICD，可以增强其免疫原性，有利于促进肿瘤免疫治疗。牛乳铁蛋白肽（Bovinelactoferricin,LfcinB）是一种被广泛研究的阳离子抗癌肽，它不仅能诱导肿瘤细胞发生ICD，还兼具刺激淋巴细胞增殖和促进细胞因子分泌的功能，在肿瘤免疫治疗中具有良好的应用前景。但LfcinB经静脉给药时易失活，并且缺乏肿瘤富集能力，因此难以实现理想的肿瘤治疗效果。刺激响应型纳米给药系统可保护药物活性、改善药物的体内分布、实现药物的可控释放、降低药物毒副作用，因此有望提高LfcinB的肿瘤靶向免疫治疗效果。<br>　　本研究合成了上临界溶解温度（Uppercriticalsolutiontemperature,UCST）为43℃的聚-（丙烯酰胺-丙烯腈）-聚乙二醇，以阳离子多肽LfcinB为模型药物，与在水溶液中带负电的透明质酸和带正电的聚-（丙烯酰胺-丙烯腈）-聚乙二醇通过电荷相互作用制备三元复合纳米粒（LHPN），实现对LfcinB的有效负载，载药量为13.3±0.38%，包封率为91.3±0.53%。所得LHPN呈规则均一的球形，粒径为52.9±1.31nm，表面电位为-10.24±0.98mV。LHPN具有明显的pH和温度刺激响应性体外药物释放行为，在生理条件下（37℃pH7.4）释放缓慢且不完全，而在刺激条件下（43℃pH5.5）则可实现药物的快速完全释放。<br>　　以小鼠结肠癌细胞CT26为模型细胞，在43℃培养箱中孵育30min作为高温处理操作，考察LHPN的体外抗肿瘤和免疫刺激效果。空白纳米粒和本研究所采用的43℃高温处理均表现出良好的生物安全性。与游离LfcinB相比，LHPN被摄取后可在CT26细胞内滞留较长时间而不被降解或外排，有利于更好地发挥药效。此外，LHPN在细胞水平也呈现pH和温度响应性的药物释放行为，当LHPN被细胞摄取后，在溶酶体的酸性环境及外部43℃高温刺激下迅速释放LfcinB，通过破坏线粒体膜电位而引起显著的细胞凋亡，同时伴随着ICD发生，使CT26细胞暴露大量DAMPs。在小鼠脾脏淋巴细胞和CT26细胞共孵育体系中加入LHPN并辅以43℃高温处理后，淋巴细胞被刺激产生比其他各组更强烈的免疫反应。<br>　　通过皮下注射肿瘤细胞的方式分别构建CT26和B16荷瘤小鼠模型，以尾静脉注射LHPN的方式来评价体内分布、肿瘤抑制和免疫激活情况。结果表明LHPN具有良好的肿瘤靶向性，小鼠接受LHPN辅以微波热疗的方案后，肿瘤生长受到显著抑制，肿瘤组织发生明显的坏死现象，并且新生血管也受到抑制，小鼠生存期显著延长。肿瘤组织呈现较高程度的ICD，DAMPs的暴露水平较高，此外，肿瘤和脾脏中的抗肿瘤免疫细胞和免疫因子明显增加，而调节性T细胞的数量则下降，说明小鼠肿瘤免疫微环境得到了改善，全身性抗肿瘤免疫反应被有效激活。当荷瘤小鼠体内的CD8+T细胞被耗竭后，LHPN辅以微波热疗策略的肿瘤抑制和免疫激活效果显著下降，说明LHPN主要通过激活CD8+T细胞来发挥肿瘤免疫治疗效果。荷瘤小鼠在接受LHPN治疗期间体重保持稳定，并且各器官均未发生明显病变，说明LHPN具有良好的体内安全性。<br>　　在肿瘤发生ICD的过程中，会释放大量三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate,ATP）用于招募DCs和刺激其成熟，但ATP被胞外核苷酸酶降解后会在肿瘤微环境中产生大量降解产物腺苷（Adenosine,ADO），与广泛存在于各种免疫细胞表面的2A型腺苷受体（A2AR）结合后，会刺激免疫细胞的抑制通路，加剧免疫抑制。而A2AR的拮抗剂则可以通过阻断ADO与A2AR的结合来缓解该抑制现象。因此，当具有ICD诱导能力的药物与A2AR的拮抗剂联合应用时，可以解决ICD诱导的抗肿瘤免疫和ADO介导的免疫抑制之间的矛盾。<br>　　纳米给药系统在体内进行药物递送时，容易被网状内皮系统捕获，体循环时间较短，因此其分布到肿瘤组织的比例有限。白细胞具有良好的体内循环性、天然的炎性部位（如肿瘤）趋向能力、“隐形功能”以及跨越生物屏障的能力，因此其作为纳米给药系统的运载工具具有良好的应用前景。本研究在前期研究的基础上，合成了UCST为43℃的次氮基三乙酸-聚乙二醇-聚-（丙烯酰胺-丙烯腈）嫁接物，该嫁接物在水性介质中可自组装成胶束，临界胶束浓度为33.2μg/mL，且该胶束的形态具有温度敏感性。以具有ICD诱导能力的疏水性化疗药物阿霉素（Doxorubicin,DOX）和疏水性A2AR拮抗剂SCH58261为模型药物，通过溶剂扩散法制备载药胶束（DSM），粒径为164.0±7.0nm，电位为3.93±0.05mV，在胶束表面引入E-选择素后，得到E-选择素修饰的载药胶束（ES-DSM），粒径为247.7±15.6nm，电位为-1.2±0.09mV。载药胶束对药物具有良好的负载能力，对DOX的载药量为2.7±0.01%，包封率为92.9±0.61%，对SCH58261的载药量为0.41±0.005%，包封率为41.8±0.97%。ES-DSM具有明显的温度敏感性体外药物释放行为，在生理条件下（37℃）释放缓慢且不完全，而在高温条件下（43℃）的释放速率明显加快，与游离药物的扩散速率接近。<br>　　以小鼠乳腺癌细胞4T1为模型细胞，在43℃培养箱中孵育30min作为高温处理操作，考察ES-DSM的体外抗肿瘤和免疫刺激效果。结果表明，空白胶束和本研究所采用的43℃高温处理均具有良好的生物安全性。ES-DSM在细胞水平也表现出温敏型药物释放行为，向细胞中加入ES-DSM并辅以43℃处理时，胶束的疏水内核发生溶解，胶束结构破坏，从而使药物迅速释放，其中DOX可以在有效杀伤肿瘤细胞的同时诱导ICD的发生。在与免疫细胞的共孵育体系中，发生ICD的肿瘤细胞可以有效刺激DCs的成熟及抗原提呈，进一步刺激T细胞的增殖和分化；在含有腺苷模拟物NECA的共孵育体系中，SCH58261的存在可以拮抗NECA与DCs或T细胞表面A2AR的结合，从而解除免疫细胞的免疫抑制状态，有利于发挥抗肿瘤作用。<br>　　采用乳垫注射肿瘤细胞的方式构建4T1荷瘤小鼠模型，以尾静脉注射ES-DSM的方式来评价药物的体内分布、肿瘤抑制及免疫激活情况，并进一步考察其抗肺转移、抑制复发肿瘤以及再接种肿瘤的效果。结果表明，ES-DSM经静脉注射后可在E-选择素的介导下有效粘附于白细胞表面，在白细胞的运载作用下表现出比DSM更多的肿瘤积累量。积累在肿瘤部位的载药胶束在局部微波热疗的刺激下迅速释放药物，促进肿瘤细胞发生凋亡和坏死，显著抑制肿瘤生长，并且减少体内自发性肺转移灶的形成，而耗竭小鼠体内CD8+T细胞会极大削弱以上效果，说明ES-DSM主要通过激活CD8+T细胞来发挥免疫治疗效果。此外，肿瘤部位表现出高程度的ICD，有利于DCs的浸润和对肿瘤抗原的摄取，促进DCs的成熟及抗原提呈，最终激活T细胞免疫反应，肿瘤、外周血和脾脏中细胞毒性T细胞和抗肿瘤细胞因子的含量显著增加，记忆T细胞的数量也明显上调，而调节性T细胞的比例则降低，说明荷瘤小鼠肿瘤免疫微环境得到了改善，并且全身性免疫系统被有效激活，因此可以抑制肺转移肿瘤、术后复发肿瘤和再次接种肿瘤的生长。荷瘤小鼠在接受ES-DSM治疗期间体重保持稳定，并且各器官均未发生明显病变，说明ES-DSM具有良好的体内安全性。<br>　　本研究基于UCST型聚合物材料构建的两种刺激响应型纳米给药系统均能实现药物向肿瘤部位的靶向递送及可控释放，通过诱导肿瘤细胞发生ICD来增强其免疫原性，同时缓解肿瘤免疫抑制微环境，刺激免疫细胞的活化，最终实现高效安全的肿瘤免疫治疗。