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摘要肝纤维化是一种可逆的创伤愈合反应，由细胞外基质蛋白（extracellularmatrix，ECM）过度沉积所致，是发生在大多数类型慢性肝病中的主要病理过程。导致肝纤维化的原因有很多，非酒精性脂肪肝、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、自身免疫性肝病以及酒精性肝病等均可引起肝纤维化。如果不及时干预，会进一步导致肝硬化和肝衰竭，并显著增加肝癌的风险。由于其病因及发病机制复杂，目前临床尚无有效的治疗方案。近些年来发现Omega-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacids，PUFAs）衍生的脂质介质是细胞增殖、凋亡和抗炎的重要调节因子，因此在许多临床疾病如哮喘、癌症、自身免疫性疾病和非酒精性脂肪肝的发病机制中发挥重要作用。<br>　　因哺乳动物体内缺乏相关的Omega-3去饱和酶，所以哺乳动物体内不能够将Omega-6转化为Omega-3PUFAs。因此大量与肝纤维化相关研究多通过口服、静脉注射Omega-3PUFAs，或者局部治疗。直到2004年，Dr.Kang等人将秀丽隐形线虫的Omega-3去饱和酶的基因转入到C57BL/6小鼠中，使小鼠带有mfat-1阳性基因，从而使Omega-3/Omega-6多不饱和脂肪酸的比例上升，使不同的脂肪酸比例成为单一变量。但是，内源性产生的Omega-3PUFAs对肝纤维化发生发展的影响尚不清楚。<br>　　在肝纤维化的发展过程中，肝星状细胞（hepaticstellatecells，HSC）被激活、增殖，并进一步转分化为肌成纤维细胞，导致ECM过度沉积，最终促进纤维化形成。哺乳动物雷帕霉素靶受体（mammaliantargetreceptorofrapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白质激酶。胞内外的各种刺激如激素、生长因子、营养、能量、缺氧、应激等通过mTOR调节翻译、细胞生长增殖、自噬、血管形成等生理过程。研究发现mTOR信号在炎症的产生中发挥着重要作用，同时对肝纤维化的发生发展具有重要的影响，抑制mTOR信号通路可显著抑制实验诱导的肝纤维化、ECM合成、HSCs的激活和增殖，是目前治疗肝纤维化的重要靶点。此外，有研究报道Omega-3PUFAs对mTOR信号通路的活性具有重要的调节作用。基于此，本研究提出科学假设：mfat-1转基因小鼠能够产生内源性Omega-3PUFAs，通过调节mTOR信号通路抑制HSCs的活化，减少肝细胞的凋亡，从而延缓肝纤维化的发生发展。<br>　　研究目的：研究内源性Omega-3PUFAs对肝纤维化发生发展的影响及其作用机制，旨在为临床治疗肝纤维化提供新的视角。<br>　　研究方法：<br>　　（1）对小鼠进行基因型鉴定，根据鉴定结果分为mfat-1转基因小鼠和WT小鼠（C57BL/6），同时利用气相色谱进一步检测各组小鼠体内Omega-3/Omega-6PUFAs的比例。<br>　　（2）肝纤维化小鼠模型的建立：WT和mfat-1转基因小鼠腹腔分别注射CCl4构建肝纤维化小鼠模型，注射CCl4的溶剂玉米油（Cornoil）作为对照，小鼠共分为4组：WT-CCl4、WT-Cornoil、mfat-1-CCl4、mfat-1-Cornoil。<br>　　（3）造模结束后，取其肝脏和血清，血清进行肝功能检测，肝脏进行组织切片和冻存-80℃冰箱。1）肝功能检测：通过ELISA检测血清ALT、AST的水平。2）组织切片：①通过HE染色检测肝组织病变程度；②通过Masson染色和天狼猩红染色检测肝脏中纤维化水平；③通过免疫组化α-SMA检测肝组织中HSCs的活化水平；④通过TUNEL染色检测肝细胞的凋亡程度；⑤通过免疫荧光双染p-S6、α-SMA检测肝组织内的mTOR信号与HSCs活化的关系。3）分子生物学实验：通过WesternBlot检测肝组织内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和mTOR相关蛋白p-S6的表达；同时检测肝纤维化过程中HSCs活化标志物α-SMA的表达和胶原蛋白Collagen-1的表达。<br>　　研究结果：<br>　　（1）通过PCR检测小鼠体内的mfat-1基因，结果显示：mfat-1转基因小鼠体内含有mfat-1基因，而WT小鼠体内无mfat-1基因；同时气相色谱检测小鼠体内的多不饱和脂肪酸，结果显示：mfat小鼠与WT相比，其Omega-3/Omega-6PUFAs的比例上升，表明mfat-1小鼠能将体内的Omega-6转化成为Omega-3PUFAs，mfat-1转基因小鼠模型构建成功。<br>　　（2）通过检测血清中ALT、AST的水平，结果显示：与Cornoil对照组相比，CCl4模型组小鼠的ALT、AST的水平显著升高，表明CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠肝功能受损；CCl4组中，与WT小鼠相比，mfat-1小鼠血清中ALT和AST水平显著下降，表明mfat-1小鼠产生的内源性Omega-3PUFAs能显著改善肝功能。<br>　　（3）通过HE染色发现：与Cornoil对照组相比，CCl4模型组小鼠肝组织结构严重损伤，肝细胞出现大量坏死和炎细胞浸润，表明CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠发生肝损伤；CCl4组中，与WT相比，mfat-1小鼠的肝组织结构损伤程度明显改善，肝细胞坏死数量和炎症细胞数量显著减少。表明mfat-1小鼠产生的内源性Omega-3PUFAs显著改善纤维化肝组织损伤。<br>　　（4）通过免疫组化和WesternBlot发现：与Cornoil对照组相比，CCl4模型组小鼠肝组织中HSCs激活标志物α-SMA表达显著上调，表明CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠中HSCs发生活化；而CCl4组中，mfat-1小鼠与WT相比，α-SMA的表达显著下调；同时通过天狼星红、Masson染色以及WesternBlot发现：CCl4组中，与WT相比，mfat-1小鼠HSCs活化后所产生的胶原蛋白也明显减少。表明mfat-1小鼠产生的内源性Omega-3PUFAs能抑制HSCs的激活，同时抑制了胶原蛋白的产生。<br>　　（5）通过免疫荧光和WesternBlot发现：与Cornoil对照组相比，CCl4模型组小鼠肝组织中mTOR通路下游蛋白p-S6蛋白表达显著上调，表明CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠中mTOR通路被激活；而CCl4组中，mfat-1小鼠与WT小鼠相比，p-S6蛋白表达减少，表明mfat-1小鼠产生的内源性Omega-3PUFAs能够通过调控mTOR信号通路的活性发挥减缓肝纤维化进程的作用。<br>　　（6）通过TUNEL染色和WesternBlot发现：与Cornoil对照组相比，CCl4模型组小鼠肝组织中肝细胞凋亡的数量增加，肝细胞凋亡相关蛋白Caspase-3表达上调，促凋亡蛋白Bax表达增加，抑制凋亡蛋白BCl-2表达降低，表明CCl4诱导的肝纤维化模型小鼠中肝细胞凋亡增加；而CCl4组中，mfat-1小鼠与WT小鼠相比，肝细胞凋亡的数量明显减少，同时Caspase-3和Bax表达明显降低，BCl-2表达升高。表明mfat-1小鼠产生的内源性Omega-3PUFAs能减少肝细胞的凋亡水平<br>　　结论：<br>　　内源性Omega-3PUFAs，通过调节mTOR信号通路，抑制HSCs的激活，减少胶原纤维的产生，同时能够减少肝细胞的凋亡，改善肝功能水平，从而延缓肝纤维化的发生发展。