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摘要作为原发恶性骨肿瘤，骨肉瘤常发生于儿童和青少年时期，大约有15%-20%的患者在诊断初期就被发现存在转移，其发生发展的机制不明。深入探讨骨肉瘤发生发展的分子机制，寻找骨肉瘤基因治疗的靶点，将为有效治疗骨肉瘤提供新思路和实验依据。<br>　　目的：<br>　　探究癌蛋白Gankyrin对骨肉瘤增殖、侵袭和转移的影响，并阐明其分子机制。<br>　　方法：<br>　　采用real-timePCR和westernblot实验检测Gankyrin在骨肉瘤细胞系和人骨肉瘤组织中mRNA和蛋白表达；利用免疫组织化学染色实验检测Gankyrin在骨肉瘤组织中表达，并解析Gankyrin表达与骨肉瘤组织临床病理学特征以及患者预后的关系；采用westernblot实验检测骨肉瘤MG63细胞过表达Gankyrin和骨肉瘤U2OS细胞敲低Gankyrin对肿瘤发生发展相关信号转导通路的影响；采用real-timePCR实验检测Gankyrin对YAPmRNA表达的影响，免疫组织化学染色实验检测Gankyrin对YAP蛋白亚细胞定位的影响；利用real-timePCR和westernblot实验检测YAP对GankyrinmRNA和蛋白表达水平的影响；采用荧光素酶报告实验、westernblot实验探究Gankyrin对YAP的调控机制；免疫荧光染色、免疫共沉淀和MTT实验检测Gankyrin和YAP相互作用及对骨肉瘤细胞增殖的影响；裸鼠成瘤实验检测Gankyrin对骨肉瘤体内增殖的影响，westernblot、real-timePCR和免疫组织化学染色实验进一步检测在成瘤组织中Gankyrin对YAP的调控作用；免疫组化实验检测Gankyrin与YAP在人骨肉瘤组织中表达相关性。<br>　　利用划痕实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞迁移的影响；采用Transwell侵袭实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞侵袭的影响；分别利用real-timePCR实验和westernblot实验检测Gankyrin对骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物mRNA和蛋白表达水平的影响；分别采用real-timePCR实验和westernblot实验检测Gankyrin对Hedgehog和Wnt信号通路关键分子mRNA和蛋白表达水平的影响；免疫共沉淀实验检测Gankyrin与Gli1的相互作用；免疫荧光实验检测Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞和组织中的共定位情况；免疫组织化学染色实验检测Gankyrin与Gli1在人骨肉瘤组织标本中表达的相关性；免疫共沉淀检测Gankyrin对Gli1的泛素化调节；裸鼠肺转移瘤实验检测Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤体内肺转移的影响。<br>　　结果：<br>　　1.Gankyrin在骨肉瘤中的表达及与骨肉瘤患者不良预后的相关性<br>　　在骨肉瘤细胞系中，GankyrinmRNA和蛋白表达水平明显高于正常成骨细胞系；在人骨肉瘤组织中，GankyrinmRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织，Gankyrin高表达与肿瘤组织分化程度、肿瘤分期以及远处转移呈正相关，且Gankyrin高表达相比较于低表达患者呈现更加不良预后。<br>　　2.Gankyrin调控YAP表达的机制<br>　　2.1Gankyrin增强YAP表达，并与YAP形成正反馈回路<br>　　Gankyrin对信号传导与转录激活因子3（STAT3，signaltransducerandactivatoroftranscription3）信号通路、蛋白激酶B（Akt，proteinkinaseB）信号通路、Jun氨基末端激酶（JNK，JunN-terminalkinase）信号通路和细胞外信号调节蛋白激酶（ERK，extracellularregulatedproteinkinase）信号通路没有明显调控作用；过表达Gankyrin可以上调YAP表达水平，而敲低Gankyrin则下调YAP表达水平，然而，p-YAP、LATS1和p-LATS1表达水平并不会受Gankyrin影响；Gankyrin不会影响YAPmRNA表达水平以及YAP蛋白细胞核定位；相反地，YAP能够上调Gankyrin的mRNA和蛋白表达水平。<br>　　2.2MiR-200a对YAP调控机制<br>　　在骨肉瘤细胞中，miR-200a能够靶向结合YAP的3’-非编码区（UTR，untranslatedregions）区域，miR-200amimics（miR-200a模拟物）下调骨肉瘤细胞中YAP蛋白表达水平，而miRNA-200ainhibitors（miR-200a抑制物）上调骨肉瘤细胞中YAP蛋白表达水平。<br>　　2.3Gankyrin通过P53-miR-200a调控YAP表达的机制<br>　　过表达P53上调miR-200a水平，而敲低P53则下调miR-200a水平；过表达P53抑制YAP表达，而敲低P53下调YAP表达；敲低Gankyrin可以上调P53表达并下调YAP表达，而同时敲低Gankyrin和P53可以逆转该现象；过表达Gankyrin则可以下调P53表达并上调YAP表达，而同时过表达Gankyrin和P53可以逆转该现象；敲低Gankyrin可以上调miR-200a表达，而同时敲低Gankyrin和P53可以逆转该现象；过表达Gankyrin则可以下调miR-200a表达，而同时过表达Gankyrin和P53可以逆转该现象。<br>　　3.Gankyrin与YAP的相互作用及对骨肉瘤细胞体外增殖的影响<br>　　Gankyrin和YAP在U2OS和MG63细胞以及人骨肉瘤组织中存在共定位；Gankyrin和YAP在U2OS和MG63细胞中存在相互作用；在U2OS细胞和MG63细胞中敲低Gankyrin或YAP可以抑制骨肉瘤细胞生长，而同时敲低Gankyrin和过表达YAP或者同时敲低YAP和过表达Gankyrin则可以逆转这种现象。<br>　　4.Gankyrin对骨肉瘤体内增殖的影响<br>　　敲低Gankyrin使骨肉瘤细胞成瘤体积和重量均降低，且成瘤时间增加；过表达Gankyrin使骨肉瘤细胞成瘤体积和重量均增加，且成瘤时间减少；在敲低gankyrin的成瘤组织中，P53蛋白水平升高，Gankyrin和YAP蛋白水平降低，p-YAP蛋白水平无变化，Gankyrin和ki67染色强度降低；在过表达Gankyrin的成瘤组织中，P53蛋白水平下降，Gankyrin和YAP蛋白水平升高，p-YAP蛋白水平无变化，Gankyrin和ki67染色强度增加。<br>　　5.Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达相关性<br>　　Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达具有正相关性；Gankyrin和YAP同时呈高表达的骨肉瘤患者相对于Gankyrin高表达而YAP低表达、YAP高表达而Gankyrin低表达、Gankyrin低表达且YAP低表达的患者表现出更加不良的预后。<br>　　6.Gankyrin对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的影响<br>　　过表达Gankyrin促进骨肉瘤细胞迁移和侵袭，敲低Gankyrin抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭；此外，过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物（包括CD133、OCT4以及Nanog）mRNA和蛋白表达水平，敲低Gankyrin抑制骨肉瘤细胞中肿瘤干细胞标记物mRNA和蛋白表达水平。<br>　　7.Gankyrin调控Gli1影响骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的机制<br>　　7.1Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性的影响<br>　　敲低Gankyrin下调骨肉瘤细胞中Hedgehog（Hh）信号通路关键分子（Gli1和PTCH1）mRNA表达水平，而对Wnt信号通路关键分子（β-catenin和AXIN2）mRNA表达无影响；过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子mRNA表达水平，而对Wnt信号通路关键分子mRNA表达无影响；相应的，敲低Gankyrin下调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子蛋白表达水平，过表达Gankyrin上调骨肉瘤细胞中Hedgehog信号通路关键分子蛋白表达水平；此外，在过表达Gankyrin的同时敲低Gli1可以逆转Gankyrin诱导的肿瘤干细胞标记物上调以及骨肉瘤细胞迁移和侵袭。<br>　　7.2Gankyrin与Gli1相互作用<br>　　Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞中相互作用；Gankyrin与Gli1在骨肉瘤细胞和组织中存在共定位；此外，在人骨肉瘤组织标本中，Gankyrin与Gli1表达呈正相关；Gankyrin和Gli1同时呈高表达的骨肉瘤患者相对于Gli1高表达而Gankyrin低表达以及Gankyrin低表达且Gli1低表达的患者表现出更加不良的预后。<br>　　7.3Gankyrin调控Gli1的机制<br>　　Gankyrin通过抑制Gli1的泛素化降解上调Gli1蛋白表达水平。<br>　　8.Gankyrin调控Gli1对骨肉瘤体内肺转移的影响<br>　　过表达Gankyrin促进骨肉瘤体内肺转移，此外，在过表达Gankyrin的同时敲低Gli1可以逆转Gankyrin诱导的骨肉瘤体内肺转移。<br>　　结论：<br>　　1.Gankyrin在骨肉瘤中高表达，且与肿瘤组织分化程度、肿瘤分期以及远处转移以及患者不良预后呈正相关；<br>　　2.Gankyrin增强YAP表达，并与YAP形成正反馈回路，机制上，Gankyrin通过调控P53阻止miR-200a介导的YAP下调；<br>　　3.Gankyrin与YAP相互作用并协同促进骨肉瘤细胞体外增殖；<br>　　4.Gankyrin促进骨肉瘤体内增殖并上调YAP表达水平；<br>　　5.Gankyrin和YAP在骨肉瘤组织标本中表达具有相关性；<br>　　6.Gankyrin促进骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性；<br>　　7.Gankyrin通过上调Gli1促进骨肉瘤细胞迁移、侵袭和干细胞特性，机制上，Gankyrin与Gli1相互作用，且Gankyrin抑制Gli1蛋白泛素化降解；<br>　　8.Gankyrin通过上调Gli1促进骨肉瘤体内肺转移。