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摘要研究背景：<br>　　PBPs是位于细菌细胞膜上的一类膜蛋白，在细胞壁构建过程中能够催化反式肽反应，在细菌细胞周期中起着重要作用。PBPs的正常存在是细菌维持形态和功能的必要条件。β-内酰胺类抗生素通过与PBPs结合抑制细菌细胞壁的生物合成，引起细菌细胞死亡，从而起到杀菌作用。除了四种PBPs（pbp1、pbp2、pbp3和pbp4）外，MRSA还可以表达青霉素结合蛋白2a（PBP2a），这是一种对所有β-内酰胺类药物具有极低亲和力的结合蛋白，导致抗生素不能发挥全部作用。当高亲和力PBPs被抑制时，PBP2a能继续发挥转肽酶功能，完成细胞壁合成，维持细菌的生长繁殖，导致细菌对抗生素的耐药性。因此，开发具有潜在特异性的PBP2a抑制剂以克服目前大多数抗生素的多重耐药迫在眉睫。<br>　　近年来虚拟筛选已成为快速、经济、高效的药物发现和药物优化的重要工具。该方法基于疾病的分子生物学基础，利用生物大分子的三维结构作为靶点进行先导化合物筛选，比传统的药物发现方法更加有效。多重虚拟筛选策略已经广泛应用于抗菌药物的发现。<br>　　研究目的：<br>　　在本项研究中，采用一种虚拟筛选和生物学评价相结合的策略，目的是从商业数据库中发现PBP2a抑制剂，以提供新型的靶向PBP2a的抗MRSA药物先导化合物。<br>　　研究方法：<br>　　体外筛选：采用DiscoveryStudio2017软件构建一种混合虚拟筛选方法，包括类药性评价（利宾斯基五规则筛选和ADMET预测）和基于刚性（LibDock程序）和半柔性（CDOCKER程序）对接的虚拟筛选，用于从商用化合物数据库筛选新的PBP2a抑制剂；对筛选出的化合物进行抗MRSA活性和正常肝细胞毒性研究，进一步筛选出具有潜在价值的PBP2a抑制剂；随后用表面等离子体共振（SPR）实验和分子动力学（MD）模拟验证最终命中化合物与PBP2a结合的亲和力，并分析结合模式。<br>　　活性实验：选择PBP2a抑制能力最强的化合物hit2，研究其对MRSA临床分离株的抗菌作用，检测MIC值和MBC值；RT-PCR研究hit2对MRSA05临床分离株的细胞壁合成相关基因表达的影响；使用MRSA05临床分离株感染SPF级昆明小鼠，建立致死模型和亚致死模型；研究化合物hit2对致死菌量MRSA05临床分离株攻击小鼠的生存保护作用；研究亚致死菌量MRSA05临床分离株感染小鼠后hit2对小鼠血液中菌量的影响；小鼠腹腔注射给药后观察hit2的急性毒性，HE染色检测重要脏器的病理变化。<br>　　研究结果:<br>　　体外筛选：通过虚拟筛选筛选出11个命中化合物；在这些化合物中，hit2、hit3和hit10在体外表现出良好的抗MRSA活性（MIC范围为2-64μg/mL）和弱毒性（对L-02细胞系IC50gt;20μΜ）；SPR和MD实验结果表明，三种hit化合物与PBP2a结合良好，KD值为10-7次方数量级；配体-受体复合物相互作用研究表明，所有hit化合物都能很好地且适应性地结合到PBP2a蛋白的变构位点。<br>　　活性实验：MIC和MBC结果显示hit2在体外对MRSA临床分离株的普遍适用性，对MRSA05的抗菌效果最好，其对13株MRSA临床分离株的MIC50值、MIC90值、MBC50值和MBC90值分别是3.4、9.6、44.1和126.1?μg/mL，抗MRSA能力与万古霉素相似；时间-杀菌曲线实验显示hit2能够呈剂量依赖性的杀灭MRSA05；扫描电镜和RT-PCR检测发现Hit2能够破坏MRSA细胞壁的合成而不影响肽聚糖合成相关基因（agr、femX、mecA、pbp2、pbp3、pbp4、murC、murE、vraR、mrp）、磷壁酸合成相关基因（tagA、tagB、tagD、tagG、tagX）、细胞壁水解相关调控基因（ssaA、saeR、murD、sarA、lytM）的表达，间接证实其抗菌机制可能是结合PBP2a有关；构建了MRSA05临床分离株感染的SPF级小鼠模型，发现3.0×1010CFU/kg浓度可作为MRSA05小鼠亚致死模型给菌量，7.0×1010CFU/kg浓度可作为MRSA05小鼠致死模型给菌量；体内抗菌实验结果证实化合物hit2对致死菌量MRSA攻击小鼠有显著的保护作用，可显著降低亚致死菌量MRSA感染小鼠血液中的菌量，抗菌能力与万古霉素相似；急性毒性实验证实化合物hit2具有良好的治疗安全性，治疗浓度远小于半数致死量；HE染色显示重要脏器心肝脾肺肾在药物20mg/kg浓度条件下无明显损伤。<br>　　结论：<br>　　本研究所设计的基于虚拟筛选和活性评价的混合筛选策略能够有成为一种有效的PBP2a抑制剂筛选方法。筛选出的命中化合物hit2是一种很有前途的PBP2a抑制剂，具备成为抗MRSA药物先导化合物的条件。这些结果为进一步研究新型抗MRSA药物提供了重要信息。