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摘要中枢神经系统（Centralnervoussystem,CNS）脱髓鞘疾病是以CNS多灶区炎性脱髓鞘为主要病理表现的一种自身免疫性疾病。临床较为常见的CNS脱髓鞘疾病包括多发性硬化（multiplesclerosis,MS）、视神经脊髓炎（neuromyelitisoptica,NMO）、急性散播性脑脊髓炎（acutedisseminatedencephalomyelitis,ADEM）等。其中以MS最常见，其病理改变为CNS内白质多发性髓鞘脱落。目前，包括MS在内的中枢脱髓鞘疾病的病因与发病机制尚未完全明确，并且临床面临着难治愈、易复发、治疗药物副作用大的困境。随着研究的深入，我们发现MS的发病与髓鞘碎片积累及其导致的脑内氧化应激与神经炎症微环境有关，并且干扰轴突的再生与修复，抑制髓鞘的再生。因此，改善大脑局部氧化应激与炎性微环境，清除髓鞘碎片对MS的治疗与预后极为重要。而小胶质细胞对于改善脑内微环境、清除髓鞘碎片具有重要作用，是允许重新髓鞘化的关键因素。<br>　　CNS脱髓鞘疾病属于中医脑病。中医脑病是指多种因素综合作用，致使脑和脊髓功能异常的一类疾病，临床表现复杂多样，多伴有头痛、眩晕、健忘、少气懒言、腰膝酸软、心烦、情绪低落等症状，严重危害人类生命健康。其病因有外感、内伤、外伤、先后天等多种因素。本病与肝、脾、肾三脏密切相关，以气血内虚、脏腑功能失调为基础，加之内伤外感、劳倦过度而发，中医辩证多以气血亏虚、肝肾阴虚与脾肾亏虚为主。中医药凭借整体调理、调节阴阳以及多靶点、全方位的优势在MS等CNS脱髓鞘疾病中发挥着一定的作用。<br>　　淫羊藿，为小檗科植物淫羊藿的全草，是常见补益中药，具有补肾壮阳、祛风除湿等作用。淫羊藿总苷（Icariin，ICA）是淫羊藿总黄酮的主要活性成分，结构式为C33H40O15，相对分子质量为676.67，结构上属于8-异戊烯基黄酮醇苷类化合物，是国内外学者研究的热点之一。近年来，ICA对神经保护作用的研究日渐增多，研究发现ICA具有减轻氧化应激、抑神经炎症反应、影响氨基酸类等神经递质的释放及支持神经营养等作用，对CNS病如阿尔兹海默病（Alzheimer''sdisease,AD）、抑郁症及中风等具有良好的防治作用。鉴于同样存在着氧化应激和炎性反应等病理变化，故我们考虑用ICA来治疗CNS脱髓鞘疾病，并探讨其机制。<br>　　本研究中，首先通过DPPH、ABST和FRAP清除自由基法检测ICA清除自由基能力；其次，通过体外脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导小胶质细胞/巨噬细胞氧化与炎症模型和体内CPZ诱导脱髓鞘模型，探讨ICA通过促进小胶质细胞/巨噬细胞抗氧化与抗炎作用促进髓鞘修复再生的作用机制；最后，我们观察到ICA在体内外实验中促进小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片，并改善大脑氧化与炎症反应，改善脱髓鞘，并探讨其促进髓鞘再生修复的细胞和分子机制。<br>　　第一部分ICA通过非细胞依赖的方式清除自由基<br>　　目的：本实验通过DPPH、ABST和FRAP清除自由基法检测ICA清除自由基能力。<br>　　方法：96孔板中，分别加入270μl的DPPH、ABTS与FRAP溶液，30μl不同浓度的ICA溶液（1.5625、3.125、6.25、12、25、50、100μg/mL），以无水乙醇作为空白对照。室温下避光孵育30min，多功能酶标仪检测，单个样品均进行3次独立重复实验。<br>　　结果：ICA的DPPH自由基清除活性从14.763%变化到81.086%，IC50为17.98μg/ml；FRAP自由基清除活性为15.477%到75.783%，FRAP的IC50为20.7μg/ml；ABTS自由基清除活性从13.435%变化到61.863%，IC50为36.5μg/ml。<br>　　结论：ICA具有清除自由基与抗氧化能力，且在检测范围内与其浓度呈正相关，即随着检测浓度增加，ICA抗自由基、氧化能力也增强。<br>　　第二部分ICA通过调节氧化应激与炎症间的动态平衡促进髓鞘再生<br>　　目的：通过观察ICA对双环己酮草酰二腙（Cuprizone,CPZ）诱导C57BL/6中枢脱髓鞘小鼠模型的治疗作用，并探讨其可能的作用机制。<br>　　方法：本研究包含体内与体外两部分实验。<br>　　（1）体外实验：BV2细胞中加入不同浓度的ICA（1.5625、3.125、6.25、12、25、50、100μg/mL）干预24h，通过MTT法检测细胞增殖情况；BV2、原代小胶质细胞、BMDMs以1×106密度接种于6孔板，贴壁后分别加入LPS、ICA，37℃下孵育24h，建立小胶质细胞/巨噬细胞氧化与炎症模型。检测氧化应激产物NO、MDA和H2O2与抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的表达含量；检测TNF-α、IL-1β、IL-10与TGF-β分泌。<br>　　（2）体内实验：C57BL/6小鼠随机分为Normal组、CPZ组、CPZ+ICA组。Normal组用普通饲料喂养6周；CPZ组、CPZ+ICA组用含0.2%CPZ饲料饲养6周，诱导脱髓鞘。4周末，CPZ组小鼠腹腔注射NS2周，CPZ+ICA组小鼠腹腔注射ICA（50mg/Kg）2周。6周后，对小鼠进行行为学检测；随后对动物进行取材，采用黑金染色（BlackGoldⅡ）和MBP免疫病理染色检测髓鞘脱失程度；试剂盒与ELISA法检测小鼠脑组织中NO、MDA、H2O2和SOD、CAT、GSH-Px的表达；TNF-α、IL-1β、IL-10与TGF-β的分泌；通过免疫荧光染色，检测脑组织内Iba-1、iNOS、Arg-1、TLR4、NF-κB、Nrf2、HO-1、PDGF-Rα、Ki67和CNPase的表达。<br>　　结果：<br>　　1.筛选体外实验ICA的最佳浓度。MTT结果显示，Normal组与12.5μg/mLICA组、Normal组与25μg/mLICA组，有统计学差异（Plt;0.05）。因此，我们选择了15μg/mL进行后续的体外实验。<br>　　2.LPS干预BV2、原代小胶质细胞与BMDMs，诱导氧化应激与炎症模型。结果发现：①氧化应激:LPS+ICA组对BV2显著降低了NO和MDA的产生（分别为plt;0.05和plt;0.01），增加抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px表达（分别为plt;0.05，plt;0.01和plt;0.001）；LPS+ICA组显著降低了原代小胶质细胞NO和H2O2的产生（均plt;0.05），增加抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px表达（分别plt;0.01，plt;0.01和plt;0.001）；LPS+ICA组也显著降低BMDMs中NO和H2O2的产生（分别为plt;0.05和plt;0.01），升高抗氧化酶SOD和CAT的表达（均plt;0.05）。②神经炎症:ELISA显示，LPS诱导小胶质细胞/巨噬细胞分泌大量TNF-α（分别plt;0.01，plt;0.01，plt;0.001）与IL-1β（分别plt;0.05，plt;0.001，plt;0.001）等炎性因子，而LPS+ICA组TNF-α（分别plt;0.05，plt;0.05，plt;0.01）与IL-1β（分别plt;0.05，plt;0.01，plt;0.01）的分泌均下降；相较于LPS组，LPS+ICA组原代小胶质细胞及BMDMs也分泌较高的抗炎因子IL-10（均plt;0.05）。<br>　　3.ICA可改善CPZ诱导脱髓鞘小鼠的行为异常与髓鞘脱失。强迫游泳和高架十字迷宫表明，CPZ+ICA组小鼠显著降低了进入闭合手臂的总休息时间和到达平台的时间（分别plt;0.001，plt;0.05）。黑金II染色表明，与CPZ组相比，CPZ+ICA组减轻了胼胝体区脱髓鞘程度（plt;0.01）。MBP免疫荧光染色显示CPZ+ICA组明显增加了髓鞘染色强度（plt;0.01）。<br>　　4.ICA抑制CPZ脱髓鞘模型的氧化应激与神经炎症反应。与体外实验一致，amp;nbsp;同CPZ喂养的小鼠相比，ICA处理有效抑制脱髓鞘小鼠脑组织中氧化产物NO、H2O2和MDA的含量（分别为plt;0.05，plt;0.01，plt;0.05），抑制炎性因子TNF-α与IL-1β的分泌（均plt;0.01）；增加SOD、CAT和GSH-Px抗氧化产物的含量（分别为plt;0.001，plt;0.05，plt;0.05），并促进抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌（均plt;0.05）。<br>　　5.ICA抑制小胶质细胞的激活与富集。免疫荧光染色显示，与CPZ组相比，CPZ+ICA组有效降低了胼胝体区Iba-1+小胶质细胞表达数量（plt;0.01）。<br>　　6.ICA诱导M2型小胶质细胞极化。结果显示，对比CPZ组，CPZ+ICA组降低了胼胝体区Iba-1+小胶质细胞iNOS的表达（plt;0.01），增加了Arg-1的表达（plt;0.001）。<br>　　7.ICA激活Nrf2/HO-1抗氧化信号通路。免疫荧光法检测脑内Nrf2/HO-1的表达。结果表明，与CPZ组相比，CPZ+ICA组则显著增加Nrf2和HO-1表达（分别plt;0.001、plt;0.01）。<br>　　8.ICA抑制小胶质细胞TLR4和P-NF-kB/p65的表达。免疫荧光染色TLR4和P-NF-kB/p65发现，相比CPZ组，CPZ+ICA组明显抑制Iba-1+小胶质细胞表达TLR4和P-NF-kB/p65（均plt;0.001）。<br>　　9.ICA诱导OPCs的再生与分化。研究表明，对比CPZ组，CPZ+ICA组PDGF-Rα+与Ki67+、CNPase+细胞显著增多（均plt;0.001）。<br>　　结论：氧化应激与神经炎性是脱髓鞘疾病中主要的生理病理反应。我们的结果表明，ICA能减少小胶质细胞/巨噬细胞氧化与炎症反应，改善脑内微环境，有利于髓鞘的修复与再生。<br>　　第三部分ICA促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片并减轻神经炎症与氧化应激<br>　　目的：基于ICA在小胶质细胞中的抗氧化和抗炎作用，我们考虑ICA有可能促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片，以发挥髓鞘保护和髓鞘再生的作用。因此，在本研究中，我们观察了ICA促进小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片并改善大脑内氧化应激和炎症反应，治疗脱髓鞘疾病的潜力，并探讨了其细胞和分子作用机制。<br>　　方法：本研究包含体内与体外两部分实验。<br>　　（1）体外实验：培养BV2、BMDMs，以1.3×105密度接种于48孔板，贴壁后加入CFSE-Myelindebris、ICA，37℃孵育箱孵育24h，建立小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片模型。荧光显微镜观测ICA能否促进小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片；通过免疫荧光染色检测Iba-1、MBP、TREM2、iNOS、Arg-1、TLR4、Nrf2的表达；取细胞培养上清液，检测NO、ROS、RNS、TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。<br>　　（2）体内实验：C57BL/6小鼠随机分为Normal组、CPZ+Myelin组、CPZ+Myelin+ICA组。Normal组用普通饲料喂养6周；CPZ+Myelin组、CPZ+Myelin+ICA组用含0.2%CPZ饲料喂养6周，诱导脱髓鞘。四周末，CPZ+Myelin组与CPZ+Myelin+ICA组，通过脑立体定位于小鼠脑单侧胼胝体区注射CFSE标记的髓鞘碎片后，CPZ+Myelin组腹腔注射NS两周，CPZ+Myelin+ICA组腹腔注射ICA（50mg/Kg）两周。造模6周后，对动物进行取材，通过免疫荧光染色检测脑组织内Iba-1、MBP、TREM2、iNOS、Arg-1、TLR4、Nrf2表达；通过Westernblot检测脑组织内TREM2、iNOS、Arg-1、TLR4、Nrf2蛋白含量。<br>　　结果：<br>　　1.ICA促进小胶质细胞/BMDMs吞噬髓鞘碎片。体内通过免疫荧光染色发现CPZ+Myelin+ICA组小鼠胼胝体区域存在Iba-1和MBP共定位，共定位部分还包裹了CFSE标记的髓鞘碎片。之后通过体外实验发现BV2和BMDMs细胞质中有明显的绿色颗粒，且Myelin+ICA组比Myelin组多（分别plt;0.05，plt;0.01）。<br>　　2.ICA诱导M2型小胶质细胞/BMDMs极化促进吞噬髓鞘碎片。体内实验通过免疫荧光染色与Westernblot发现，与CPZ+Myelin组相比，CPZ+Myelin+ICA组在促进小胶质细胞吞噬髓鞘碎片过程中降低了iNOS表达（分别plt;0.001，plt;0.01）；增加了Arg-1表达（均plt;0.01）。通过体外实验验证了这一结果，发现与Myelin组相比，Myelin+ICA组降低了Iba-1/iNOS/CFSE-Myelindebris共表达的细胞数（分别plt;0.01，plt;0.001），增加了Iba-1/Arg-1/CFSE-Myelindebris共表达的细胞数（均plt;0.01）。<br>　　3.ICA高表达TREM2受体促进小胶质细胞/BMDMs吞噬髓鞘碎片。在体内实验中，免疫荧光染色与Westenblot发现与CPZ+Myelin组相比，CPZ+Myelin+ICA组确实可以增加TREM2的表达（分别plt;0.001，plt;0.01）。体外采用ICA干预BV2/BMDMs细胞，经免疫荧光，发现对比于Myelin组，Myelin+ICA组明显促进TREM2受体的高表达（均plt;0.01）。<br>　　4.ICA促进小胶质细胞/BMDMs吞噬髓鞘碎片并减轻神经炎症。体内免疫荧光与Westernblot发现，与CPZ+Myelin组相比，CPZ+Myelin+ICA组中TLR4的表达降低（均plt;0.01）。体外BV2/BMDMs免疫荧光染色结果同体内一致（均plt;0.01）。同时取细胞培养上清液，检测炎性因子分泌情况。结果发现，Myelin+ICA组TNF-α（分别plt;0.05，plt;0.001）、IL-1β（分别plt;0.01，plt;0.05）和IL-6（均plt;0.05）的分泌显著降低。<br>　　5.ICA促进小胶质细胞/BMDMs吞噬髓鞘碎片并减轻脑内氧化应激。体内免疫荧光与Westernblot发现，与CPZ+Myelin组相比，CPZ+Myelin+ICA组中Nrf2的表达降低（分别plt;0.001，plt;0.01）。体外培养的BV2/BMDMs细胞中，通过免疫荧光发现，Myelin+ICA组的Nrf2表达明显增加（分别plt;0.05，plt;0.01）。培养细胞上清液中检测NO、ROS和RNS的表达，结果显示在BMDM中，Myelin+ICA组减少了NO、ROS和RNS的产生（分别plt;0.05，plt;0.05，plt;0.01）。<br>　　结论：本研究表明ICA通过上调TREM2受体，促进小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片，下调TLR4/TNF-α和上调Nrf2，减轻神经炎症和氧化应激，改善脑内微环境，为髓鞘的修复和再生创造有利环境。<br>　　淫羊藿作为补肾壮阳的传统中草药，其现代药理作用广泛，尤其在CNS疾病中发挥的作用越来越受重视。本研究应用生物学和免疫学的方法进行研究，取得了有意义的发现。证实了ICA具有清除自由基和抗氧化能力，并在一定范围内与其浓度呈正相关；ICA通过调节Nrf2介导的抗氧化与NF-κB介导的神经炎症间动态平衡治疗CPZ诱导的脱髓鞘；ICA还可以通过上调TREM2信号通路，下调TLR4/Nrf2信号通路，促进小胶质细胞/巨噬细胞吞噬髓鞘碎片，为髓鞘的修复与再生创造良好环境。这些结果对于淫羊藿，特别是ICA在CNS脱髓鞘疾病中的作用进行深入的研究提供了有意义的线索。