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摘要目的：<br>　　通过对体外培养的小鼠原代海马神经元进行麦芽酚铝处理，研究铝对海马神经元网络的损伤，以及miR-29a靶向调控PTEN-GSK3β信号通路在铝致神经网络损伤中的作用及机制。<br>　　方法：<br>　　1．体外培养小鼠原代海马神经元（24h内新生的ICR乳鼠），培养第三天时半量换液且加入阿糖胞苷，2天后换新的不含阿糖胞苷的培养液，在培养第六天时使用细胞免疫荧光染色的方法标记神经元特异性蛋白微管相关蛋白（microtubule-associatedprotein2，MAP2）确定神经元的纯度；使用不同浓度的麦芽酚铝（maltolaluminum,Al(mal)3）处理神经元，用CCK-8确定染毒时间和染毒剂量。<br>　　2.将神经元分为对照组、10μmol/LAl(mal)3组、20μmol/LAl(mal)3组、40μmol/LAl(mal)3组，慢病毒感染的方法转mNeonGreen（绿色荧光蛋白）进入神经元，使用微电极阵列分析仪（Micro-ElectrodeArray,MEA）分析神经网络的放电情况；使用高内涵细胞成像技术分析（HighContentAnalysis,HCA）记录神经元突起的长度和神经元的分支数；使用激光共聚焦显微镜观察神经元的树突棘，并计算树突棘的密度和神经元的复杂程度；使用qRT-PCR检测miR-29a和PTENmRNA的表达水平；WesternBlot检测PTEN、PI3K、Arc、NMDAR2B、PSD95蛋白的表达水平，以及p-Akt和p-GSK3β的表达水平。<br>　　3.慢病毒感染的方法转染miR-29a进入神经元，将转染组分为转染对照组（mNeonGreen，mNG）、mNG+20μmol/LAl(mal)3组、miR-29a组、miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组，使用MEA分析神经元及神经网络的放电情况；使用HCA记录神经元突起的长度和神经元的分支数；用激光共聚焦显微镜观察转染后神经元的树突棘，并分析树突棘的密度和神经元的复杂程度；使用qRT-PCR检测转染后miR-29a和PTENmRNA的表达水平；WesternBlot检测转染后神经元PTEN、PI3K、Arc、NMDAR2B、PSD95蛋白的表达水平，以及p-Akt和p-GSK3β的表达水平。<br>　　结果：<br>　　1.细胞免疫荧光染色实验表明小鼠海马神经元纯度在90%以上。使用CCK-8检测细胞活力，10μmol/L、20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3处理后的神经元的存活率在80%以上，作用时间为48h。<br>　　2.对接种于MEA板上的小鼠原代海马神经元，经过Al(mal)3处理后，会出现自发性放电减弱现象，以Al(mal)3作用后0h的神经元网络的兴奋性参数的值作为基线，结果以各参数与0h的各参数值的百分比表示，对照组神经元在Al(mal)3处理48h时，spikefrequency（自发放电频率）为（227.85±55.0）%，theburstfrequency（簇放电频率）为（73.18±46.4）%，thenetworkburstfrequency（网络簇放电频率）为（75.41±33.0）%，synchronizationindex（同步指数）为（117.13±15.5）%，在铝剂量组神经网络兴奋性相关参数数值均降低，并呈现一定的剂量反应关系（Plt;0.05），尤以20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3组最为显著，铝显然抑制了神经元的自发放电频率，伴有神经元网络簇放电同步性减弱，铝作用剂量越大，对神经元放电活动的损伤越严重。<br>　　3.使用慢病毒感染的方法转染mNeonGreen进入神经元，对转染mNeonGreen的神经元使用HCA观察，发现神经元细胞饱满、密集、边界清楚，多条突起形成神经元网络，经过Al(mal)3处理48h后，海马神经元平均突起数量和平均突起长度相对减少（Plt;0.05），平均突起数量在20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3组分别为（69.7±12.96）%和（58.5±20.43）%，平均突起长度分别为（74.8±11.8）%和（71.3±8.88）%，表明铝可以影响神经突的伸长，抑制神经突的生长，抑制神经元网络的形成；对转染mNeonGreen的神经元使用激光共聚焦显微镜观察，结果发现全细胞表达绿色荧光，清楚的看到神经元的树突棘沿着树突的走向分布，对照组神经元树突棘密度为（5.097±1.209）thorns/10μm，Al(mal)3处理后的神经元树突棘密度减少（Plt;0.05），呈一定的剂量依赖性，尤以20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3组降低最为明显，树突棘密度分别为（3.662±0.495）thorns/10μm，（2.958±0.492）thorns/10μm，与对照组相比差异有统计学意义（Plt;0.05）；同时使用免疫荧光化学染色标记神经元特异的MAP2后，使用激光共聚焦显微镜观察并进行Sholl分析，结果表明，随着Al(mal)3浓度的增加，神经元树突的复杂程度降低；<br>　　4.使用不同浓度的Al(mal)3处理神经元细胞后，随着剂量的增加，miR-29a的表达水平降低（Plt;0.05），20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3组分别下降35.0%、49.3%，PTENmRNA的表达水平升高（Plt;0.05），20μmol/L、40μmol/LAl(mal)3组分别升高44.0%、58.9%。Westernblot结果表明Al(mal)3处理神经元后，PTEN蛋白的表达水平升高，PI3K、Arc、PSD95和NMDAR2B蛋白的表达水平下降（Plt;0.05），p-Akt和p-GSK3β的蛋白表达水平下降（Plt;0.05）。<br>　　5.慢病毒感染的方法转染miR-29a进入海马神经元，使神经元过表达miR-29a，随机分为转染对照组（mNG）、mNG+20μmol/LAl(mal)3组、miR-29a组、miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组；MEA分析结果发现，与mNG组相比，mNG+20μmol/LAl(mal)3组自发放电频率、簇放电频率、网络簇放电频率和同步指数均明显降低，差异有统计学意义（Plt;0.05）；与mNG+20μmol/LAl(mal)3组相比，miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组的自发放电频率、簇放电频率和网络簇放电频率均明显升高，差异有统计学意义（Plt;0.05）；HCA分析结果显示，与mNG组相比，mNG+20μmol/LAl(mal)3组平均突起长度和突起分支数明显减少（Plt;0.05），与mNG+20μmol/LAl(mal)3组相比，miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组平均突起长度和突起分支数明显增加（Plt;0.05）；激光共聚焦显微镜观察树突棘结果显示，与mNG组相比，mNG+20μmol/LAl(mal)3组树突棘密度明显降低，神经元复杂程度降低，miR-29a组树突棘密度明显升高（Plt;0.05），复杂程度升高；与mNG+20μmol/LAl(mal)3组相比，miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组树突棘密度和复杂程度均升高（Plt;0.05）；qRT-PCR结果发现，与转染对照组相比，染铝组PTENmRNA表达水平升高为（229.06±45.5）%（Plt;0.05），miR-29a组神经元PTENmRNA表达水平下降为（40.50±16.7）%（Plt;0.05），与mNG+20μmol/LAl(mal)3组比较，miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组PTENmRNA表达明显降低（Plt;0.05），westernblot结果显示，miR-29a组PTEN表达显著下降，mNG+20μmol/LAl(mal)3组PTEN表达显著上升（Plt;0.05）。与mNG+20μmol/LAl(mal)3组比较，miR29a+20μmol/LAl(mal)3组PTEN蛋白显著降低（Plt;0.05）；慢病毒转染miR-29a后各组蛋白的相对表达结果显示，与mNG组相比，mNG+20μmol/LAl(mal)3组PI3K、p-Akt、p-GSK3β、Arc、PSD95和NMDAR2B蛋白的表达水平降低，miR-29a组的PI3K、p-Akt、p-GSK3β、Arc、PSD95和NMDAR2B蛋白的表达水平增加（Plt;0.05）；与mNG+20μmol/LAl(mal)3组相比，miR-29a+20μmol/LAl(mal)3组的PI3K、p-Akt、p-GSK3β、Arc、PSD95和NMDAR2B蛋白的表达水平明显升高（Plt;0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.铝可致海马神经元网络损伤，表现为抑制神经元生长，降低神经元树突的复杂程度，减少神经元树突棘密度，抑制神经元的放电活动。<br>　　2.铝可以抑制突触生长或突触传递相关蛋白的表达，影响神经元信息传递进而损伤神经元网络。<br>　　3.铝可能通过减少miR-29a的表达，增加PTEN蛋白的表达，进而抑制PI3K/Akt/GSK3β信号通路损伤神经元网络。