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Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织脂质代谢和炎症反应的影响及机制研究

摘要目的:<br>  构建纯合型Plin1基因敲除小鼠品系,为研究PLIN1相关功能提供专属特异的动物模型;观察Plin1基因敲除对高脂饲料诱导小鼠肥胖的相关影响;进一步探究PLIN1对脂肪组织脂质代谢和炎症水平的作用及其可能分子机制。<br>  方法:<br>  1.通过显微注射、CRISPR/Cas9和胚胎移植技术构建Plin1基因敲除小鼠,并进行品系纯化。根据Plin1基因2号外显子序列设计、筛选、合成sgRNA后构建质粒型sgRNA表达载体,双酶切法和基因测序验证载体构建是否成功;按照sgRNA试剂盒说明书体外转录sgRNA,琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA的完整性和片段大小,超微量分光光度计测定sgRNA纯度和浓度;HCG和PMSG诱导8-10周龄雌性C57BL/6j小鼠超数排卵,之后与同周龄雄性小鼠合笼以获取受精卵;利用显微注射技术将sgRNA与Cas9蛋白的混合物递送至受精卵原核中;注射后状态良好的受精卵胚胎移植入假孕雌鼠输卵管伞端,F0代小鼠19-21d后出生提取其DNA,PCR扩增Plin1基因,琼脂糖凝胶电泳和基因测序验证和筛选F0代嵌合体小鼠;F0代嵌合体小鼠与同窝别的野生型异性小鼠近交,19-21d孕鼠分娩获得F1代小鼠,琼脂糖凝胶电泳法检测Plin1基因片段大小,筛选杂合型阳性敲除小鼠;杂合型阳性敲除异性小鼠同窝别近交,19-21d后获得F2代小鼠,按照上述方法进一步检测Plin1基因片段大小,筛选出纯合型Plin1基因敲除小鼠;纯合型异性小鼠Plin1基因片段大小近交扩群,子代出生后提取DNA进行基因鉴定,若结果均为纯合型则表明Plin1基因敲除小鼠品系构建成功。Westernblot和RT-PCR法检测小鼠脂肪组织、肝组织及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA表达水平进一步区分野生型小鼠、杂合型Plin1基因敲除小鼠及纯合型Plin1基因敲除小鼠。<br>  2.研究Plin1基因敲除对小鼠肥胖和脂肪组织脂质代谢的作用及机制。12只雄性野生型C57BL/6j小鼠和12只Plin1基因敲除小鼠,随机分为4组(n=6):对照组(CON-C组),野生型小鼠6只,敲除组(KO-C组),Plin1基因敲除小鼠6只,均饲以D12450B对照饲料(10%脂肪热能,3.85kcal/g);高脂组(CON-H组),野生型小鼠6只,敲除高脂组(KO-H组),Plin1基因敲除小鼠6只,均饲以D1245145%高脂饲料(45%脂肪热能,4.7kcal/g)。12周后。检测小鼠体重、体长及摄食量变化;实验结束前2周,葡萄糖耐量实验测定小鼠糖耐量水平;胰岛素耐受实验测定小鼠胰岛素抵抗水平;利用耗氧量测定比较小鼠能量代谢率;实验结束后处死所有小鼠,试剂盒在各组小鼠血清中检测TG、TC、甘油、NEFAs、LDL-c和HDL-c水平;观察并称量比较各脏器变化;HE染色后观察白色及棕色脂肪组织病理形态学变化;RT-PCR法检测脂肪组织中hsl、atgl、fas及acc基因mRNA表达差异;Westernblot法在各组小鼠白色脂肪组织中检测HSL、p-HSL、ATGL及SREBP1蛋白表达差异;体外培养小鼠脂肪组织并施加胰岛素(INS)或异丙肾上腺素(ISO)干预,检测培养基中NEFAs和甘油水平。<br>  3.研究Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织炎症反应的影响及机制。取各组小鼠血清及部分附睾脂肪组织体外培养基,酶联免疫吸附试验在小鼠脂肪组织培养基和血清中测定TNF-α、IL-6及MCP-1的水平;IHC染色法观测白色脂肪组织中炎性标志分子F4/80的表达程度;IHF(单标)染色法观察白色脂肪组织中NF-κB亚基P65的转位及表达水平;RT-PCR法检测附睾脂肪组织中tnf-α、il-6及mcp-1mRNA表达差异;Westernblot法检测附睾脂肪组织中NF-κB亚基P65表达及磷酸化差异。<br>  结果:<br>  1.成功设计并构建Plin1基因的质粒型sgRNA表达载体,体外转录获得了浓度大于5000ng/L高纯度的完整sgRNA;完成了受精卵的原核注射和胚胎移植,野生小鼠Plin1基因片段大小为1236bp,敲除小鼠Plin1基因片段大小为495bp;获得了纯合型Plin1基因敲除小鼠(Plin1-/-)及品系;杂合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白表达及mRNA水平显著降低(Plt;0.05),纯合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA基本无表达。<br>  2.喂养12周后,与CON-C组相比,KO-C小鼠体重、体长、摄食量、GTT水平无显著改变(Pgt;0.05),能量代谢率和ITT水平升高,白色脂肪组织重量减轻,脂滴空泡占比减小,而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比增加(Plt;0.05),血清HDL-c和NEFAs水平显著升高(Plt;0.05),脂肪组织中脂解酶ATGL、HSL及p-HSL表达及mRNA水平升高,SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低(Plt;0.05),脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高,INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小(Plt;0.05),ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化程度不显著。与CON-C组相比,CON-H组小鼠明显肥胖,代谢率降低,GTT及ITT水平升高(Plt;0.05),肝脏及脂肪组织重量增加,脂肪组织中脂滴面积均增大,血脂水平升高(Plt;0.05),脂解酶表达及mRNA水平降低,SREBP1表达及fas和acc基因mRNA水平升高(Plt;0.05),脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高,INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小(Plt;0.05),ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化不显著。与CON-H组相比,KO-H组体重显著降低,能量代谢率显著升高(Plt;0.05),白色脂肪组织重量减轻,脂滴空泡占比减小,而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比进一步增加,血清TG、TC及NEFAs水平显著减低,HDL-c、LDL-c及甘油水平升高(Plt;0.05),脂肪组织中脂解酶表达及mRNA水平均升高,SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低(Plt;0.05),脂肪组织基础、INS及ISO干预培养基中甘油和NEFAs水平均升高(Plt;0.05)。<br>  3.与CON-C组相比,CON-H组小鼠血清与脂肪组织培养基中TNF-α和IL-6水平均显著升高,MCP-1水平表现为在血清中变化不显著而在脂肪组织培养基中显著升高(Plt;0.05)。脂肪组织中M1型巨噬细胞浸润增多、NF-κBP65荧光强度及核转位增多、p-P65表达升高,tnf-α、il-6及mcp-1基因mRNA水平显著升高(Plt;0.05);KO-C组小鼠血清和脂肪组织具有类似改变,但tnf-α和il-6基因mRNA表达水平无显著变化。与CON-H相比,KO-H组小鼠血清中IL-6和MCP-1无显著改变,TNF-α水平显著升高,而在脂肪组织培养基中上述分子水平均显著升高。脂肪组织F4/80表达、P65荧光强度及核转位、p-P65表达及促炎基因mRNA均显著升高(Plt;0.05)。<br>  结论:<br>  1.利用CRISPR/Cas9、显微注射和胚胎移植技术成功构建了Plin1基因敲除小鼠,并获得了稳定遗传的纯合型Plin1基因敲除小鼠(Plin1-/-)及其品系,为研究PLIN1的相关功能提供了专属特异的动物模型。<br>  2.Plin1基因敲除通过上调脂解酶、下调脂质合成转录因子及下游靶基因的表达,促进小鼠脂肪组织中脂解作用并抑制了脂质合成,改善了HFD诱导的小鼠肥胖。<br>  3.Plin1基因敲除促进肥胖小鼠脂肪组织的炎症反应,其机制可能为PLIN1失活介导的脂解加剧,促进了M1型巨噬细胞的极化与浸润,并激活NF-κB通路导致促炎因子的合成与释放。

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