检索历史 清除

摘要目的：<br>　　构建纯合型Plin1基因敲除小鼠品系，为研究PLIN1相关功能提供专属特异的动物模型；观察Plin1基因敲除对高脂饲料诱导小鼠肥胖的相关影响；进一步探究PLIN1对脂肪组织脂质代谢和炎症水平的作用及其可能分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.通过显微注射、CRISPR/Cas9和胚胎移植技术构建Plin1基因敲除小鼠，并进行品系纯化。根据Plin1基因2号外显子序列设计、筛选、合成sgRNA后构建质粒型sgRNA表达载体，双酶切法和基因测序验证载体构建是否成功；按照sgRNA试剂盒说明书体外转录sgRNA，琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA的完整性和片段大小，超微量分光光度计测定sgRNA纯度和浓度；HCG和PMSG诱导8-10周龄雌性C57BL/6j小鼠超数排卵，之后与同周龄雄性小鼠合笼以获取受精卵；利用显微注射技术将sgRNA与Cas9蛋白的混合物递送至受精卵原核中；注射后状态良好的受精卵胚胎移植入假孕雌鼠输卵管伞端，F0代小鼠19-21d后出生提取其DNA，PCR扩增Plin1基因，琼脂糖凝胶电泳和基因测序验证和筛选F0代嵌合体小鼠；F0代嵌合体小鼠与同窝别的野生型异性小鼠近交，19-21d孕鼠分娩获得F1代小鼠，琼脂糖凝胶电泳法检测Plin1基因片段大小，筛选杂合型阳性敲除小鼠；杂合型阳性敲除异性小鼠同窝别近交，19-21d后获得F2代小鼠，按照上述方法进一步检测Plin1基因片段大小，筛选出纯合型Plin1基因敲除小鼠；纯合型异性小鼠Plin1基因片段大小近交扩群，子代出生后提取DNA进行基因鉴定，若结果均为纯合型则表明Plin1基因敲除小鼠品系构建成功。Westernblot和RT-PCR法检测小鼠脂肪组织、肝组织及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA表达水平进一步区分野生型小鼠、杂合型Plin1基因敲除小鼠及纯合型Plin1基因敲除小鼠。<br>　　2.研究Plin1基因敲除对小鼠肥胖和脂肪组织脂质代谢的作用及机制。12只雄性野生型C57BL/6j小鼠和12只Plin1基因敲除小鼠，随机分为4组（n=6）：对照组（CON-C组），野生型小鼠6只，敲除组（KO-C组），Plin1基因敲除小鼠6只，均饲以D12450B对照饲料（10%脂肪热能,3.85kcal/g）；高脂组（CON-H组），野生型小鼠6只，敲除高脂组（KO-H组），Plin1基因敲除小鼠6只，均饲以D1245145%高脂饲料（45%脂肪热能,4.7kcal/g）。12周后。检测小鼠体重、体长及摄食量变化；实验结束前2周，葡萄糖耐量实验测定小鼠糖耐量水平；胰岛素耐受实验测定小鼠胰岛素抵抗水平；利用耗氧量测定比较小鼠能量代谢率；实验结束后处死所有小鼠，试剂盒在各组小鼠血清中检测TG、TC、甘油、NEFAs、LDL-c和HDL-c水平；观察并称量比较各脏器变化；HE染色后观察白色及棕色脂肪组织病理形态学变化；RT-PCR法检测脂肪组织中hsl、atgl、fas及acc基因mRNA表达差异；Westernblot法在各组小鼠白色脂肪组织中检测HSL、p-HSL、ATGL及SREBP1蛋白表达差异；体外培养小鼠脂肪组织并施加胰岛素（INS）或异丙肾上腺素（ISO）干预，检测培养基中NEFAs和甘油水平。<br>　　3.研究Plin1基因敲除对肥胖小鼠脂肪组织炎症反应的影响及机制。取各组小鼠血清及部分附睾脂肪组织体外培养基，酶联免疫吸附试验在小鼠脂肪组织培养基和血清中测定TNF-α、IL-6及MCP-1的水平；IHC染色法观测白色脂肪组织中炎性标志分子F4/80的表达程度；IHF（单标）染色法观察白色脂肪组织中NF-κB亚基P65的转位及表达水平；RT-PCR法检测附睾脂肪组织中tnf-α、il-6及mcp-1mRNA表达差异；Westernblot法检测附睾脂肪组织中NF-κB亚基P65表达及磷酸化差异。<br>　　结果：<br>　　1.成功设计并构建Plin1基因的质粒型sgRNA表达载体，体外转录获得了浓度大于5000ng/L高纯度的完整sgRNA；完成了受精卵的原核注射和胚胎移植，野生小鼠Plin1基因片段大小为1236bp，敲除小鼠Plin1基因片段大小为495bp；获得了纯合型Plin1基因敲除小鼠（Plin1-/-）及品系；杂合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白表达及mRNA水平显著降低（Plt;0.05），纯合型Plin1基因敲除小鼠脂肪组织、肝脏及骨骼肌中PLIN1蛋白及mRNA基本无表达。<br>　　2.喂养12周后，与CON-C组相比，KO-C小鼠体重、体长、摄食量、GTT水平无显著改变（Pgt;0.05），能量代谢率和ITT水平升高，白色脂肪组织重量减轻，脂滴空泡占比减小，而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比增加（Plt;0.05），血清HDL-c和NEFAs水平显著升高（Plt;0.05），脂肪组织中脂解酶ATGL、HSL及p-HSL表达及mRNA水平升高，SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低（Plt;0.05），脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高，INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小（Plt;0.05），ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化程度不显著。与CON-C组相比，CON-H组小鼠明显肥胖，代谢率降低，GTT及ITT水平升高（Plt;0.05），肝脏及脂肪组织重量增加，脂肪组织中脂滴面积均增大，血脂水平升高（Plt;0.05），脂解酶表达及mRNA水平降低，SREBP1表达及fas和acc基因mRNA水平升高（Plt;0.05），脂肪组织基础状态下培养基中甘油和NEFAs水平升高，INS干预后培养皿中甘油和NEFAs水平降低程度较小（Plt;0.05），ISO干预后培养基中的甘油和NEFAs水平变化不显著。与CON-H组相比，KO-H组体重显著降低，能量代谢率显著升高（Plt;0.05），白色脂肪组织重量减轻，脂滴空泡占比减小，而棕色脂肪组织中脂滴空泡占比进一步增加，血清TG、TC及NEFAs水平显著减低，HDL-c、LDL-c及甘油水平升高（Plt;0.05），脂肪组织中脂解酶表达及mRNA水平均升高，SREBP1c表达及fas和acc基因mRNA水平降低（Plt;0.05），脂肪组织基础、INS及ISO干预培养基中甘油和NEFAs水平均升高（Plt;0.05）。<br>　　3.与CON-C组相比，CON-H组小鼠血清与脂肪组织培养基中TNF-α和IL-6水平均显著升高，MCP-1水平表现为在血清中变化不显著而在脂肪组织培养基中显著升高（Plt;0.05）。脂肪组织中M1型巨噬细胞浸润增多、NF-κBP65荧光强度及核转位增多、p-P65表达升高，tnf-α、il-6及mcp-1基因mRNA水平显著升高（Plt;0.05）；KO-C组小鼠血清和脂肪组织具有类似改变，但tnf-α和il-6基因mRNA表达水平无显著变化。与CON-H相比，KO-H组小鼠血清中IL-6和MCP-1无显著改变，TNF-α水平显著升高，而在脂肪组织培养基中上述分子水平均显著升高。脂肪组织F4/80表达、P65荧光强度及核转位、p-P65表达及促炎基因mRNA均显著升高（Plt;0.05）。<br>　　结论：<br>　　1.利用CRISPR/Cas9、显微注射和胚胎移植技术成功构建了Plin1基因敲除小鼠，并获得了稳定遗传的纯合型Plin1基因敲除小鼠（Plin1-/-）及其品系，为研究PLIN1的相关功能提供了专属特异的动物模型。<br>　　2.Plin1基因敲除通过上调脂解酶、下调脂质合成转录因子及下游靶基因的表达，促进小鼠脂肪组织中脂解作用并抑制了脂质合成，改善了HFD诱导的小鼠肥胖。<br>　　3.Plin1基因敲除促进肥胖小鼠脂肪组织的炎症反应，其机制可能为PLIN1失活介导的脂解加剧，促进了M1型巨噬细胞的极化与浸润，并激活NF-κB通路导致促炎因子的合成与释放。