Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制-论文-万方医学网

Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制

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摘要邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP]作为最常用邻苯二甲酸酯（phthalateesters，PAEs）类的增塑剂，广泛存在于环境介质中，可通过呼吸、饮食和皮肤接触等途径进入婴幼儿体内。进入体内的DEHP可在肝脏和小肠细胞中首先水解并通过其他代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯[mono-(2-ethylhexyl)phthalate，MEHP]对机体产生毒性作用。 　　神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）是最常见的小儿颅外恶性肿瘤，严重危害儿童的生命健康。一些环境内分泌干扰物能够促进神经母细胞瘤的增殖和迁移。DEHP作为一种具有神经毒性作用的环境内分泌干扰物可能影响神经母细胞瘤的增殖和迁移，但其作用机制尚不清楚。 　　本研究通过体外培养神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞并给予MEHP暴露，明确MEHP暴露对SH-SY5Y细胞增殖和迁移的影响；通过抑制Notch信号通路，探讨Notch信号通路在MEHP暴露影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用机制，可为防治神经母细胞瘤和DEHP的健康损害提供科学依据。 　　第一部分MEHP对SH-SY5Y细胞增殖的影响及其机制 　　目的： 　　明确MEHP对SH-SY5Y细胞增殖、周期和凋亡的影响，探讨细胞周期和细胞凋亡关键基因在其中的作用。 　　方法： 　　SH-SY5Y细胞采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基常规培养。给予SH-SY5Y细胞梯度浓度MEHP暴露，CCK8法检测SH-SY5Y细胞存活率；根据CCK8结果确定染毒剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、低剂量组（10μMMEHP）、中剂量组（50μMMEHP）、高剂量组（250μMMEHP），暴露时间为12h和24h。 　　采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况；实时荧光定量PCR方法检测细胞周期、凋亡关键基因C-MYC、CyclinD1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2mRNA表达水平；westernblot方法检测细胞周期、凋亡关键蛋白C-MYC、CyclinD1、CDK4、P27、Bax、Bcl-2的表达水平。采用IBMSPSS24.0进行统计分析，MEHP暴露组和对照组多组间差异比较采用单因素方差分析（OneWayANOVA），组间两两比较采用LSD检验法（Least-SignificantDifference），非正态数据采用秩和检验。检验水准为α=0.05。 　　结果： 　　1.MEHP暴露12h和24h后，各染毒剂量组SH-SY5Y细胞存活率均明显高于对照组（P＜0.05）；随着暴露时间的增加，32、64、128、250、500和1000μMMEHP组细胞存活率明显升高（P＜0.05）。 　　2.MEHP暴露12h和24h后，MEHP暴露组G1期细胞数量均显著减少（P＜0.05），MEHP组细胞S期细胞百分比增加（P＜0.05）。 　　3.MEHP暴露12h和24h，MEHP暴露组SH-SY5Y细胞凋亡水平显著减低（P＜0.05）；且24h组250μMMEHP暴露组细胞凋亡水平低于12h组（P＜0.05）。 　　4.MEHP暴露12h和24h后，中、高剂量组C-MYC、CyclinD1mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）；CDK4和P27的mRNA和蛋白表达水平无明显变化（P＞0.05）。 　　5.MEHP暴露12h和24h后，中、高剂量组SH-SY5Y细胞BaxmRNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05）；Bcl-2mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）。 　　结论： 　　1.MEHP暴露可以调节SH-SY5Y细胞周期、抑制细胞凋亡，促进SH-SY5Y细胞增殖。 　　2.MEHP暴露能够上调细胞周期关键蛋白C-MYC、CyclinD1的表达，加速细胞周期，促进SH-SY5Y细胞增殖。 　　3.MEHP暴露能够调节细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，抑制SH-SY5Y细胞凋亡，促进神经母细胞瘤增殖。 　　第二部分MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响及其机制 　　目的： 　　明确MEHP对SH-SY5Y细胞迁移的影响，探讨细胞迁移关键基因和趋化因子在其中的作用。 　　方法： 　　SH-SY5Y细胞培养和实验分组与染毒同第一部分。采用ELISA法检测趋化因子VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8分泌水平；划痕实验检测细胞迁移水平；transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力；实时荧光定量PCR方法检测细胞迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、TWIST、Vimentin、HIF-1α、GPR81和VersicanmRNA表达水平；westernblot方法检测细胞迁移关键蛋白表达水平。 　　结果： 　　1.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的迁移距离，MEHP暴露24h后，细胞的迁移距离显著增加（P＜0.05）。 　　2.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的侵袭能力，中、高剂量MEHP暴露组细胞侵袭能力显著升高（P＜0.05）。 　　3.MEHP暴露可增加SH-SY5Y细胞的VEGF、PDGF以及TGF-β1的分泌水平，且24h组VEGF、PDGF和TGF-β1水平显著高于12h组（P＜0.05）。 　　4.MEHP暴露12h和24h后，中、高剂量组SH-SY5Y细胞E-Cadherin基因mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组和DMSO组（P＜0.05）；高剂量组N-Cadherin基因mRNA和蛋白表达水平显著高于其余各组（P＜0.05）；与12h暴露组相比，24h高剂量组SH-SY5Y细胞N-CadherinmRNA的表达水平升高（P＜0.05）；中剂量组Vimentin基因mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），高剂量组Vimentin基因mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组、DMSO组和低剂量组；与12h暴露组相比，24h各剂量组VimentinmRNA的表达水平升高（P＜0.05）；中、高剂量组SNAIL基因mRNA和蛋白表达升高（P＜0.05）；中、高剂量MEHP暴露组HIF-1α基因mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），与12h暴露组相比，24h高剂量组SH-SY5Y细胞HIF-1αmRNA的表达水平更高（P＜0.05）；中、高剂量MEHP暴露组Versican基因mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组和DMSO组（P＜0.05），与12h暴露组相比，24h高剂量SH-SY5Y细胞VersicanmRNA的表达水平升高（P＜0.05）。 　　结论： 　　1.MEHP暴露可促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。 　　2.MEHP暴露可调控迁移关键基因E-Cadherin、N-Cadherin、SNAIL、Vimentin、HIF-1α和Versican的表达，促进SH-SY5Y细胞迁移和侵袭。 　　3.MEHP暴露可能通过上调趋化因子VEGF、PDGF和TGF-β1的分泌，增强SH-SY5Y细胞的迁移能力。 　　第三部分MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响 　　目的： 　　明确MEHP对SH-SY5Y细胞Notch信号通路的影响，探讨Notch信号通路蛋白表达水平与SH-SY5Y细胞增殖和迁移以及相关基因表达的关系。 　　方法： 　　实验分组与染毒同第一部分。实时荧光定量PCR方法检测细胞Notch信号通路基因mRNA表达水平；westernblot方法检测细胞Notch信号通路基因的蛋白表达水平。采用Pearson相关分析检验Notch信号通路蛋白表达与SH-SY5Y细胞增殖、迁移及其相关蛋白的相关性。 　　结果： 　　1.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4、Dll-1和Jagged-2mRNA表达水平，降低Dll-4mRNA表达水平（P＜0.05）。 　　2.MEHP暴露可增加中、高剂量组SH-SY5Y细胞Notch-1、Notch-2、Notch-3和Jagged-2蛋白表达水平，降低Dll-4蛋白表达水平（P＜0.05）。 　　3.MEHP暴露12h和24h后，SH-SY5Y细胞周期和细胞凋亡水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4等蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。 　　4.MEHP暴露12h和24h后，细胞周期关键蛋白CDK4表达水平与Dll-1蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；CyclinD1和C-MYC蛋白表达水平与Notch-1、Notch-2、Notch-4、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。MEHP暴露12h和24h后，凋亡相关蛋白Bax的表达水平与Notch-1、Notch-4和Dll-4蛋白表达水平显著相关，Bcl-2的表达水平与Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。 　　5.MEHP暴露12h和24h后，SH-SY5Y细胞迁移和侵袭能力与Notch-1、Jagged-2、Dll-1和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。 　　6.MEHP暴露12h和24h后，细胞迁移相关蛋白E-Cadherin表达水平与Notch-1和Jagged-2蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；N-Cadherin蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；SNAIL蛋白表达水平与Notch-4、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；Vimentin和HIF-1α蛋白表达水平与Notch-1、Jagged-2和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；Versican蛋白表达水平与Notch-1、Notch-4和Jagged-2蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。 　　7.MEHP暴露12h和24h后，趋化因子VEGF的表达水平与Notch-2和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；PDGF的表达水平与Notch-1、Notch-4、Dll-1和Jagged-2蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；TGF-β1的表达水平与Notch-3和Dll-4蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）；CXCL-8的表达水平与Jagged-2蛋白表达水平显著相关（P＜0.05）。 　　结论： 　　1.MEHP暴露可上调Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Jagged-2的蛋白表达水平，下调Dll-4的蛋白表达水平。 　　2.MEHP暴露所致SH-SY5Y细胞的增殖和迁移与Notch通路蛋白表达密切相关。 　　3.Notch信号通路可能通过调节细胞增殖和迁移关键基因的表达在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中发挥作用。 　　4.Notch信号通路可能通过调节细胞趋化因子的分泌在MEHP促进SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。 　　第四部分Notch信号通路在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制 　　目的： 　　明确Notch信号通路在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中的作用及其机制。 　　方法： 　　采用DAPT抑制Notch信号通路表达，westernblot方法检测Hes-1蛋白表达水平，检测Notch信号通路的抑制效率。暴露剂量与实验分组为空白对照组、溶剂对照组（0.1%DMSO）、DAPT组（50μMDAPT）、MEHP组（250μMMEHP）和MEHP＋DAPT组（50μMDAPT+250μMMEHP），暴露时间为24h。Westernblot方法检测细胞Notch信号通路抑制后细胞增殖和迁移相关蛋白表达水平，其余实验方法同第一部分。数据处理与分析方法同第一部分。 　　结果： 　　1.SH-SY5Y细胞DAPT暴露后24h后，各剂量组（0、5、10、25、50、100μMDAPT）细胞存活率无明显变化（P＞0.05）；经50μMDAPT处理的SH-SY5Y细胞内Hes-1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Notch信号通路被有效抑制。 　　2.DAPT可显著逆转MEHP所致SH-SY5Y细胞S期细胞数量增多。 　　3.细胞凋亡结果显示，MEHP组和DAPT+MEHP组细胞凋亡水平显著降低（P＜0.05）。 　　4.细胞迁移情况结果显示，MEHP组和DAPT＋MEHP组细胞迁移距离显著增加（P＜0.05）；与MEHP组相比，DAPT＋MEHP组细胞迁移距离降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。 　　5.细胞侵袭结果显示，MEHP组和DAPT＋MEHP组细胞侵袭水平显著增加（P＜0.05），与MEHP组相比，DAPT＋MEHP组细胞侵袭水平降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。 　　6.趋化因子结果显示，MEHP组和DAPT＋MEHP组细胞VEGF、PDGF、TGF-β1和CXCL-8水平显著增加（P＜0.05）；且DAPT＋MEHP组细胞VEGF和TGF-β1水平显著低于MEHP组（P＜0.05）。 　　7.细胞周期和凋亡相关蛋白结果显示，MEHP组和DAPT＋MEHP组细胞C-MYC、Bcl-2蛋白表达水平升高，Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；DAPT＋MEHP组C-MYC、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平显著低于MEHP组（P＜0.05）。 　　8.细胞迁移相关蛋白结果显示，MEHP组和DAPT＋MEHP细胞Vimentin、SNAIL、HIF-1α和Versican蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；MEHP组和DAPT＋MEHP组细胞E-Cadherin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；DAPT＋MEHP组HIF-1α和N-Cadherin蛋白表达水平显著低于MEHP组（P＜0.05）。 　　结论： 　　1.Notch信号通路能在MEHP促进SH-SY5Y细胞增殖和迁移中起正向调控作用。 　　2.Notch信号通路可能通过调节细胞周期关键蛋白CyclinD1、C-MYC，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，在MEHP影响SH-SY5Y细胞增殖中发挥作用。 　　3.Notch信号通路可能通过调节细胞迁移关键蛋白N-Cadherin的表达在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。 　　4.Notch信号通路可能影响肿瘤细胞趋化因子VEGF和TGF-β1的分泌在MEHP影响SH-SY5Y细胞迁移中发挥作用。