检索历史 清除

摘要螺旋藻在我国养殖资源储量丰富，包含丰富的蛋白质、多糖、维生素、膳食纤维等，具有极高的营养价值和生物活性。其中，具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等生物活性的螺旋藻多糖研究尤其引人关注，免疫调节活性被认为是螺旋藻多糖最重要的生物活性之一，然而由于螺旋藻多糖结构复杂，多糖结构与免疫调节活性构效关系研究尚浅，限制了螺旋藻多糖的深入开发利用。因此本文从螺旋藻多糖的分离纯化，对免疫抑制小鼠的免疫调节活性检测，进而对螺旋藻多糖的理化性质，结构表征，结合螺旋藻多糖的免疫调节活性作用机制进行了系统的关联性研究。本文研究内容如下：<br>　　1.结合微波和超声辅助提取技术的优点，探讨微波-超声联合辅助提取螺旋藻粗多糖（PSP-C）的最佳工艺条件，通过单因素实验，响应面法优化分析的自变量因素，通过整个实验区域内自变量的优化组合，得到PSP-C的双波最优提取工艺条件为：提取温度75.16℃，提取时间19.31min，料液比1:92.35时，可以得到PSP-C的最大提取率为8.09%。乙醇/硫酸铵双水相体系（ATPS）可以有效去除PSP-C中的蛋白、核酸等杂质，蛋白残留率仅为0.051%。<br>　　2.动物试验结果表明，连续灌胃1-1.5g/kgBW/day剂量的PSP两周能够明显改善环磷酰胺（CPA）所致免疫低下小鼠的免疫功能，主要体现在:(1)高剂量PSP组与CPA模型组相比，小鼠的骨髓有核细胞（BMNC）数提高了57.2%；外周血白细胞（PEBC）和B淋巴细胞（PBL）数分别上升了54.4%和70.5%；骨髓嗜多染红细胞微核率（MNPCE）降低了16.8%；(2)小鼠单核/巨噬细胞的吞噬指数(碳廓清能力)提高了12.8%，小鼠血清中IL-10，TNF-α和IFN-γ的含量分别提高了30.8%，20.1%和30.1%。(3)小鼠胸腺和脾脏的病理切片证明螺旋藻多糖对小鼠胸腺和脾脏的损伤具有修复作用。<br>　　3.将PSP进一步通过DEAE-纤维素52柱层析分离可得3种螺旋藻多糖组分PSP-1（62.03%），PSP-2（27.66%），PSP-3（10.31%）。三种PSP组分均不能完全复溶于水。紫外扫描光谱显示，PSP-1和PSP-2基本不含蛋白质或核酸等杂质，PSP-3的紫外扫描光谱在260nm处有明显吸收峰，推测结构中包含一种共价结合的芳香族化合物。高效液相色谱（HPLC）结合蒸发光散射检测器（ELSD）检测三种多糖分子量，三种PSP组分均出现多个分子量组分峰，为分子量不均一多糖，分子量集中在6.4kDa-50kDa之间。红外光谱分析显示PSP-1，PSP-2和PSP-3为吡喃型多糖，PSP-2和PSP-3中含有硫酸基和β型糖苷键。三种多糖PSP-1、PSP-2和PSP-3的糖醛酸含量分别为3.65±0.15%，13.62±1.02%，32.68±2.68%，PSP-1几乎不含硫酸根基团，PSP-2和PSP-3的硫酸根含量分别为16.82%±1.31、17.62%±1.05。<br>　　4.对三种螺旋藻多糖组分的单糖成分解析表明，三种PSP组分单糖种类比较相似，都含有葡萄糖（Glc），鼠李糖（Rha），甘露糖（Man），半乳糖（Gal），木糖（Xyl），阿拉伯糖（Ara），岩藻糖（Fuc）和葡萄糖醛酸（GlcA）。PSP-2和PSP-3还含有半乳糖醛酸（GalA）。PSP-1主要由Glc，Rha和Man组成；PSP-2主要由Glc，Gal和Rha组成；PSP-3主要由Rha，Glc和Xyl组成。PSP-1的GC-MS分析结果得到11种糖醇乙酸酯，属于4种单糖组分Glc、Gal、Man和Ara。所得到的糖残基全部为吡喃型糖残基，Glc残基有1-、1,3-、1,4-、1,6-、1,3,6-和1,2,3,6-六种连接方式，占64.7%；Gal残基有1-和1,6-两种连接方式，占18.4%；Man残基有1,3-和1,3,6-两种连接方式，占13.7%；得到1种1,2,3-连接的Ara残基，占3.2%。PSP-1分支度DB=63.8%，分支度很高。PSP-2和PSP-3因其溶解度低、硫酸基和糖醛酸含量较高等原因，甲基化分析结果中甲基化糖醇乙酸酯种类较少，未能对其碳链连接方式进行分析。<br>　　核磁共振结果显示PSP-1，PSP-2和PSP-3中同时含α-糖苷键和β-糖苷键，其中PSP-1以α构型为主。1H-NMRδ8.0-10和13C-NMRδ170–180附近信号峰证实三种PSP组分中含有糖醛酸，其中PSP-1中含量极少；PSP三种分级组分都是带有氨基衍生物取代基的多糖，PSP-3中含有芳香族化合物。<br>　　刚果红试验表明三种PSP都可以与刚果红形成络合物，都含有三螺旋结构。原子力显微镜（AFM）和扫描电子显微镜（SEM）扫描照片分析显示三种PSP结构复杂，聚集形成网状结构，PSP支链较多。<br>　　5.为进一步考察PSP分子量对其免疫活性的影响，用超滤膜分离出分子量10kDa上下的PSP-H和PSP-L。体外免疫试验结果表明：PSP，PSP-1，PSP-2，PSP-3，PSP-H和PSP-L均能促进小鼠脾脏淋巴细胞和巨噬细胞的增殖。并能促进巨噬细胞RAW264.7分泌NO，IL-6和TNF-α等细胞因子。其中酸性多糖PSP-2促进细胞增殖、吞噬和分泌细胞因子效果优于PSP-1和PSP-3（PSP-3受浓度限制），PSP-L促进巨噬细胞增殖、吞噬作用的效果较PSP-H更显著，促进小鼠脾淋巴细胞增殖的效果明显优于其他PSP组分。以PSP-L考察PSP激活巨噬细胞RAW264.7免疫应答激活的信号通路，细胞信号通路研究表明，TLR4是PSP-L作用于巨噬细胞RAW264.7的主要受体之一，PSP-L可以激活MAPK信号通路相关蛋白的表达并能促进NF-κB的释放和核转运。这些研究表明PSP-L可以通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞的免疫应答。<br>　　综上所述，通过小鼠体内实验确定了PSP具有良好的免疫调节作用，可以有效缓解化疗药物环磷酰胺造成的免疫抑制作用。为探究PSP的免疫活性构效关系，按照多糖的酸性和分子量对PSP进行进一步分离得到5种PSP分级组分，通过RAW264.7巨噬细胞研究了PSP和5种PSP分级组分的体外免疫活性。结果表明，酸性多糖PSP-2和低分子量多糖PSP-L表现出更高的免疫调节活性，酸性基团糖醛酸和硫酸基以及分子量是影响其免疫活性的重要因素。以PSP-L考察了PSP激活巨噬细胞RAW264.7免疫应答激活的信号通路，发现PSP-L可以通过TLR4/MAPK/NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞的免疫应答。<br>　　本论文的研究工作有助于推动螺旋藻从保健食品向生物医药研究领域的转变，也将为螺旋藻多糖药物的筛选和研发提供基础的理论支撑。