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摘要哺乳动物睾丸和精子特异性表达的Slo3通道是成熟精子上主要的K+通道。Slo3通道对雄性生殖是至关重要的，Slo3通道受胞内碱化和膜电压激活导致精子胞内K+外排增加，这引起精子膜电位超极化并调控精子其他离子通道的功能。人源Slo3(hSlo3)通道既是人精子功能调控的重要一环，也是男性不育治疗药物和男性避孕药的重要靶点。目前，Slo3通道家族中只有hSlo3通道的门控环结构被解析。hSlo3通道整体结构的解析将为理解Slo3通道工作机制做铺垫，为人精子膜电位调控机制及其它离子通道受膜电位调控的机制提供新见解，为hSlo3靶点药物或特异性抗体的开发提供结构基础。要解析hSlo3通道的整体结构，前提是获得高纯度、具备生理功能的hSlo3蛋白。<br>　　目的：<br>　　建立hSlo3蛋白的真核表达系统，获取高纯度hSlo3蛋白，对获取的hSlo3蛋白进行鉴定，检测异源表达的hSlo3通道的生理功能。<br>　　方法：<br>　　（1）把hSlo3基因重组到pEGBacMam载体上，设计并构建多个克隆。使用杆状病毒Bac-To-Bac表达系统使hSlo3蛋白在HEK293S细胞表达，全程4℃非变性环境下提取纯化hSlo3蛋白。进行克隆筛选和蛋白表达纯化条件的优化，以获取高纯度的hSlo3蛋白，使用考马斯亮蓝染色、负染电镜验证蛋白的纯度和稳定性。<br>　　（2）对hSlo3杆状病毒感染的HEK293S细胞进行免疫荧光实验以验证hSlo3在细胞膜上的表达，使用WesternBlot和质谱鉴定hSlo3蛋白。<br>　　（3）用hSlo3重组质粒瞬转HEK293T细胞以进行膜片钳实验，通过不同pH的电极内液和胞外施加氯化铵验证hSlo3通道的碱性激活性质，并检验hSlo3通道对抑制剂Clofillum（克洛菲铵）和孕酮的反应。<br>　　结果：<br>　　（1）本课题摸索出的最佳hSlo3表达纯化条件如下：<br>　　最优克隆为hSlo3-2C；转染时，P4杆状病毒与HEK293S细胞的体积比为10%；纯化时液体环境为150mMNaCl，0.05%GDN，1mMDTT，pH=7.4。<br>　　通过尺寸排斥色谱结果、考马斯亮蓝染色和负染电镜确认了此条件下获取的hSlo3蛋白的均一性和稳定性良好。<br>　　（2）经免疫荧光验证，转染后hSlo3蛋白表达在HEK293S细胞膜上。经WesternBlot和质谱鉴定，获取的蛋白确为hSlo3蛋白。<br>　　（3）在HEK293T细胞上记录到的hSlo3电流表现出其典型电生理特性：电压敏感、被胞内碱化和胞外氯化铵激活、被Clofillum和孕酮抑制。