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摘要研究目的<br>　　表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)是人类和哺乳动物皮肤和粘膜常见的共生细菌。然而由于各种侵入性的治疗手段，例如骨科植入物、导尿管、心脏瓣膜、分流器等医疗设备(MDs)的大量应用以及免疫力低下的患者在医院内的获得性感染，导致表皮葡萄球菌引起的感染不断增多。表皮葡萄球菌能在各种医疗相关植入设备上形成有效适应机体微环境并且抵御抗菌药物渗透的生物膜。<br>　　由于全球范围内广谱抗菌药物的过度使用，表皮葡萄球菌对抗菌药物的耐药率呈现不断上升的趋势，导致临床可选择使用的抗菌药物逐渐受到限制。莫匹罗星是荧光假单胞菌发酵的产物，已被广泛应用于耐药葡萄球菌的去定植，可显著减少葡萄球菌血流感染的发生率。已有部分研究表明部分亚抑菌浓度的抗菌药物能促进细菌的生物膜形成能力。我们之前的研究表明亚抑菌浓度的莫匹罗星可能会通过上调cidA基因增强金黄色葡萄球菌的生物膜。在此项工作中，我们专注于研究亚抑菌浓度的莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响和作用机制。<br>　　研究方法<br>　　1.根据2020年美国临床实验室标准化协会（CLSI）制定的方法，我们用微量肉汤稀释法确定表皮葡萄球菌1457（SE1457）、表皮葡萄球菌ATCC35984和表皮葡萄球菌ATCC12228的莫匹罗星的最低抑菌浓度（MIC），并从温州医科大学附属第一医院来自不同患者分离的60株表皮葡萄球菌中挑选了生物膜弱阳性的两株莫匹罗星耐药株（SE157和SE158)和两株莫匹罗星敏感株(SE258和SE274)。<br>　　2.采用自动生长曲线检测仪(BiocreenC,Finland)测定600nm波长下的OD值，测定表皮葡萄球菌在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的生长曲线。<br>　　3.将不同浓度的莫匹罗星与表皮葡萄球菌共同培养，在96孔聚苯乙烯微量滴定板中、刚果红平板上和激光共聚焦显微镜（CLSM）评估SE1457和SE157、SE158、SE258和SE274的生物膜形成情况。<br>　　4.通过菌落计数法和玻片染色观察比较了莫匹罗星加药组和不加组的初始黏附期及成熟期的差别，细菌的疏水性实验（MATH）和细菌代谢活性测定比较亚抑菌浓度的莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜的疏水和代谢活性的影响。<br>　　5.通过由TritonX-100诱导的莫匹罗星加药组和不加莫匹罗星组的细菌生长的自溶实验，细胞外DNA（eDNA）的提取确定莫匹罗星是否促进细菌的自溶、细胞外DNA（eDNA）的释放。将DNaseI（DNA酶）加入96孔聚苯乙烯微量滴定板中，观察在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下、加DNaseI组和不加DNaseI组的表皮葡萄球生物膜形成能力。<br>　　6.通过印迹法测定莫匹罗星加药组和不加莫匹罗星组的细菌生物膜中的多糖细胞间粘附素（PIA）的差异。<br>　　7.通过转录组数据和RT-PCR进行分析和验证并确定莫匹罗星对表皮葡萄球菌生物膜的作用靶点。<br>　　8.确定靶点基因后对表皮葡萄球菌进行基因编辑，在敲除株中将靶点基因atlE进行回补。然后再次评估?atlE敲除株、atlE回补株和1457野生株的生物膜的发育形成、自溶和eDNA产生的情况。<br>　　研究结果<br>　　1.SE1457、ATCC12228和ATCC35984的莫匹罗星MIC均为0.015625μg/mL，SE258和SE274的莫匹罗星MIC为0.0625μg/mL，均为莫匹罗星敏感菌株。SE157和SE158的莫匹罗星MIC分别为256μg/mL和128μg/mL，为莫匹罗星耐药菌株。<br>　　2.将莫匹罗星加药组与不加药组加入到96孔板聚苯乙烯微量滴定板中，发现亚抑菌浓度的莫匹罗星可以显著增强生物膜弱阳性的表皮葡萄球菌，而对完全阴性的表皮葡萄球菌ATCC12228没有促进作用。刚果红平板上可以看到莫匹罗星作用后表皮葡萄球菌菌落在平板上变黑，激光共聚焦荧光显微镜（CLSM）进一步显示了莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜比未加药组的表皮葡萄球菌生物膜中活菌数量显著增多，生物膜紧密。<br>　　3.通过c.f.u计数和玻片染色观察亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜的初始黏附能力显著高于未加药组。<br>　　4.亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌的疏水能力无明显变化，但是细菌代谢活性比未加药组更低。<br>　　5.亚抑菌浓度莫匹罗星作用下的表皮葡萄球菌生物膜中eDNA的含量显著高于未加药组，且在TritonX-100诱导下的自溶能力也高于未加药组。加入DNaseI后，亚抑菌浓度的莫匹罗星增强表皮葡萄球菌生物膜的能力相较于未加DNaseI的表皮葡萄球菌生物膜的能力显著减弱。亚抑菌浓度莫匹罗星处理组与对照组生物膜之间的多糖细胞间粘附素（PIA）的差异并无统计学意义。这说明莫匹罗星可能通过促进表皮葡萄球菌自溶和eDNA的释放来促进其生物膜形成，而不是通过PIA途径。<br>　　6.通过RT-PCR进行RNA-Seq数据分析和验证后，发现亚抑菌浓度的莫匹罗星能够显著上调atlE,、cidA等自溶基因的表达，下调lrgAB的表达。通过分析atlE为上调最为显著的基因，可能是莫匹罗星作用的靶点。接下来我们发现亚抑菌浓度的莫匹罗星不能增强atlE敲除株的生物膜形成能力，我们通过构建atlE的回补株，发现回补株在亚抑菌浓度莫匹罗星作用下可以恢复一部分到SE1457野生株水平。<br>　　结论<br>　　1．亚抑菌浓度的莫匹罗星能够显著促进表皮葡萄球菌的生物膜的形成。<br>　　2．亚抑菌浓度的莫匹罗星通过上调atlE来促进细菌的自溶和eDNA的产生，从而使表皮葡萄球菌生物膜增厚。