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摘要目的:<br>　　1.收集2005年5月至2019年12月在南昌大学第一附属医院血液科及儿科住院的初诊急性早幼粒细胞白血病（APL）患者212例，分析APL患者的临床实验室特征及其与预后的关系。<br>　　2.分析PML-RARA融合基因阴性的变异型APL中可能存在的融合基因，并探讨变异型APL患者的临床实验室特征及预后情况。<br>　　3.采用细胞学和动物实验研究CPSF6-RARG融合基因的致白血病机制，为研究药物筛选提供模型。<br>　　方法：<br>　　1.收集2005年5月至2019年12月在在南昌大学第一附属医院血液科及儿科住院的初诊急性早幼粒细胞白血病（APL）患者212例，收集患者的临床资料及实验室指标，分析APL患者的免疫表型特点、荧光原位杂交（FISH）荧光信号模式特点、染色体核型特点、伴FLT3-ITD突变情况等临床特征与临床预后的关系。根据免疫表型分为跨系表达组与无跨系表达组，根据FISH荧光信号模式分为典型融合信号模式组与复杂信号模式组，根据染色体核型特点分为单独t（15；17）组与非典型的染色体核型组（包括非典型易位、伴其它染色体异常以及复杂染色体易位），根据伴FLT3-ITD突变情况分为突变阳性组以及突变阴性组，采用GraphPadprism5统计软件进行统计学分析，采用非配对t检验（正态分布）或Mann-WhitneyU检验（非正态分布）探讨各组与APL患者实验室指标的关系，采用卡方检验分析各组间的相互关系，以P＜0．05为差异有统计学意义。<br>　　2.以分析发现的PML-RARA融合基因阴性的3例变异型APL患者为研究对象，进行髓系白血病16种融合基因筛查，采用高通量基因测序技术对融合基因均阴性的患者骨髓单个核细胞进行转录组测序。采用Defuse软件分析转录组数据中的基因融合序列，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Sanger测序验证具有明确病理意义的融合基因，并总结变异型APL患者的临床实验室特征及预后情况。<br>　　3.将包装有CPSF6-RARG的慢病毒感染APL细胞系NB4细胞，验证CPSF6-RARG对ATRA诱导NB4细胞分化的影响。在小鼠前体细胞32Dcl-3细胞表达CPSF6-RARG，分析CPSF6-RARG对32Dcl-3细胞增殖、凋亡以及分化的影响；在P53缺失小鼠骨髓干细胞中过表达CPSF6-RARG，然后移植相同品系的小鼠，等小鼠发病后通过骨髓细胞形态学分析、流式细胞分析、PCR技术和WB技术等分析CPSF6-RARG的致病作用。<br>　　结果：<br>　　1.212例APL患者的临床实验室特征及其与预后关系<br>　　212例初诊的APL患者中，男性111例，女性101例，男：女为1.10：1，中位年龄为43岁（3-87岁），免疫分型组共191例患者，跨系表达组29例，占15.18%，其中，CD2阳性患者为16例，占跨系表达组的55.17%，占免疫分型组的8.38%。跨系表达组患者的初诊白细胞计数（WBC，P＜0.0001）、凝血酶原时间（PT,P=0.03）、NCCN预后分层为高危组患者比例（P=0.0009），均显著增高，且与FLT3-ITD突变明显相关（P=0.004），两组患者的年龄、血红蛋白（Hb）、血小板计数（PLT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、纤维蛋白原（Fbg）、D-二聚体（D-Dimer）、白蛋白（Alb）、乳酸脱氢酶（LDH）无明显差异，且与FISH荧光信号模式,染色体核型特点不相关。FISH荧光信号模式组共179例患者，典型融合信号模式组患者为159例，占88.83%，复杂信号模式组患者为20例，占11.17%，复杂信号模式组患者与其染色体核型特点明显相关（P=0.02），两组患者的年龄、WBC、Hb、PLT、PT、APTT、Fbg、D-Dimer、Alb、LDH无明显差异，且与免疫表型特点,是否伴FLT3-ITD突变以及NCCN预后分层不相关。染色体核型分析组共113例患者，其中，单独t（15；17）组患者80例，占70.80%，非典型的染色体核型组（包括非典型易位、伴其它染色体异常以及复杂染色体易位）患者33例，占29.20%，非典型的染色体核型组患者与其复杂信号模式明显相关（P=0.02），两组患者的年龄、WBC、Hb、PLT、PT、APTT、Fbg、D-Dimer、Alb、LDH无明显差异，且与免疫表型特点,是否伴FLT3-ITD突变以及NCCN预后分层不相关。是否伴FLT3-ITD突变组患者65例，其中突变阳性17例，占26.15%，突变阴性48例，占73.85%。FLT3-ITD突变阳性患者的初诊WBC计数（P=0.0004）、NCCN预后分层为高危组患者比例（P＜0.0001），均显著增高，且与免疫表型特点明显相关（P=0.004），两组患者的年龄、Hb、PLT、PT、APTT、Fbg、D-Dimer、Alb、LDH无明显差异，且与FISH荧光信号模式,染色体核型特点不相关。<br>　　2.3例变异型APL患者均经临床表现、骨髓细胞形态学、免疫学及细胞化学染色等确诊为急性早幼粒细胞白血病，但荧光原位杂交检测PML-RARA融合基因为阴性，RT-PCR检测16种髓系融合基因发现，患者1为STAT5b-RARA阳性，其余融合基因均阴性，而患者2和患者3筛查AML16种融合基因均阴性。进一步通过转录组测序和分析发现患者2和患者3分别携带病理意义明确的罕见型融合基因CPSF6-RARG和NUP98-RARG。患者1用全反式维甲酸（ATRA）诱导分化治疗无效，经去甲氧柔红霉素联合阿糖胞苷（IA方案）治疗后获完全缓解，之后行造血干细胞移植，处于持续缓解状态。患者2和患者3对全反式维甲酸（ATRA）诱导分化治疗以及标准的AML3+7化疗方案无效。患者2经改用高三尖杉酯碱联合阿糖胞苷（HHT+A-arc）化疗方案有效，处于持续缓解状态。患者3治疗无效死于脑出血。<br>　　3.成功构建CPSF6-RARG慢病毒表达质粒，通过感染NB4细胞发现CPSF6-RARG主要定位于细胞核中。进一步实验发现，在NB4细胞中过表达RARG和CPSF6-RARG都可以抑制ATRA诱导的CD11b表达。在32Dcl-3细胞过表达CPSF6-RARG以及RARG可以明显抑制IL3剥夺导致的细胞生长抑制，并可以抑制IL3剥夺诱导的细胞凋亡，但是在IL3存在的情况下对32Dcl-3细胞生长没有影响。另外，过表达CPSF6-RARG以及RARG可以明显抑制G-CSF诱导的32Dcl-3细胞分化。在P53缺失的骨髓造血干细胞中过表达CPSF6-RARG可导致小鼠发生白血病特征，通过PCR能够检测到发病小鼠骨髓细胞表达CPSF6-RARG，同时存在P53缺失，而在小鼠胸腺中同样可以看到P53缺失，但是没有CPSF6-RARG的基因。蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）显示小鼠骨髓细胞中存在CPSF6-RARG融合蛋白，但是在小鼠胸腺以及对照小鼠中未见CPSF6-RARG融合蛋白的表达。细胞形态学分析显示小鼠骨髓白血病细胞类似于髓系前体细胞特征，流式细胞分析发现该类细胞主要表达CD34、Sca-1、CD117、部分表达Gr-1，不表达CD3、CD19、B220等B和T淋巴细胞抗原。表明在P53缺失的情况下CPSF6-RARG可导致小鼠发生AML。<br>　　结论：<br>　　1.APL免疫表型可出现跨系表达、主要以淋系CD2为主，跨系表达与患者初诊WBC、PT、NCCN预后分层、FLT3-ITD突变明显相关。APL患者的染色体核型和FISH信号模式与临床和实验室特征无明显相关性。FLT3-ITD突变阳性与患者初诊WBC、NCCN预后分层，免疫表型特点明显相关，是患者预后不良的指标。<br>　　2.PML-RARA融合基因阴性的变异型APL临床表型，骨髓细胞形态学特征以及免疫学特征等和PML/RARA所致APL高度相似，但其发病机制不同，对ATRA和ATO治疗的敏感性以及预后也不相同。应用转录组测序可准确分析患者中可能存在的少见型融合基因，为APL进一步分型和精准治疗提供实验支持和理论依据。<br>　　3.过表达RARG和CPSF6-RARG可以抑制ATRA诱导的NB4细胞分化、抑制IL3剥夺导致的32Dcl-3细胞生长抑制、凋亡以及抑制G-CSF诱导32Dcl-3细胞分化成熟作用。同时表达CPSF6-RARG联合P53缺失可导致小鼠出现AML表型。