摘要目的:为获得具有良好抗肿瘤效果的纳米制剂并改善药物的溶解性,将广谱抗肿瘤药物与有抗肿瘤疗效的中药单体联用在当前实验研究中备受青睐。盐酸阿霉素为临床常用的化疗药物,但其有严重的心脏毒副作用。研究发现,甘草成分中异甘草素具有明显的抗肿瘤作用,并且其抗氧化作用在一定程度上可以缓解盐酸阿霉素代谢产生活性氧而引发的心脏毒性。纳米结构脂质载体作为抗癌药物载体具有缓释控释作用,同时可增加药物的溶解性,降低制剂的毒性。因此,本课题选定异甘草素(ISL)和盐酸阿霉素(DOX)为模型药物,纳米结构脂质载体(NLC)作为药物共递送系统,进行复方纳米结构脂质载体的制备研究考察其最佳制备方法;进行工艺处方优化考察最优制备处方比例;考察理化性质;研究体外释放动力学;研究大鼠的体内药动学行为,并对药动学参数进行分析;进行复方纳米结构脂质载体细胞毒性研究考察其抗肿瘤作用。<br> 方法:采用高效液相色谱法建立ISL的含量检测方法,超滤离心法测定纳米结构脂质载体的包封率;采用熔融超声乳化法制备复方纳米结构脂质载体,以包封率、载药量和粒径为评价指标进行单因素考察;采用星点设计-效应面筛选出最优处方,确定最佳工艺并进行验证;以复方纳米结构脂质载体冻干粉的外观、色泽、以及再分散性为指标,对冻干工艺进行优化;用透射电镜(TEM)观察复方纳米结构脂质载体的微观形态,激光粒度分析仪测定其粒径及粒径分布,Zeta电位,并考察冻干粉的溶血性、异常毒性和初步稳定;采用动态透析法考察复方纳米结构脂质载体的体外释放行为,并进行模型拟合;利用药动学数据处理软件DAS2.0对给药后各时间点大鼠血浆中药物浓度进行模型拟合计算,并进行药动学参数分析;采用CCK-8法筛选DOX与ISL对HeLa细胞的体外抗肿瘤有效浓度范围,并确定双药联用最佳比例范围,同法考察Free-DOX、DOX-NLC及DOX-ISL-NLC对宫颈癌HeLa细胞的毒性。<br> 结果:熔融超声乳化法制备的复方纳米结构脂质载体溶液包封率最高;确定7.5%海藻糖为最佳冻干保护剂,以最佳冻工艺制备的复方纳米结构脂质载体冻干粉中DOX平均包封率可达(88.96±0.61)%,载药量可达(5.10±0.03)%;ISL平均包封率可达(70.47±0.52)%,载药量可达(6.05±0.08)%,外观呈红色粉末状,能维持原液体积蓬松无塌陷,色泽均匀细腻,分散后呈红色透明并伴有乳光,无沉淀及粒子存在,TEM显示复方纳米结构脂质载体为均匀球形,平均粒径为162.9nm,PDI为0.195,Zeta电位为-10.2mV;无溶血和絮凝现象发生,异常毒性试验合格,符合注射液的质量要求。冻干粉在室温和4℃条件下6个月两药包封率下降变化较小,初步稳定性试验表明其稳定性良好;确立了复方纳米结构脂质载体体外释放的检测方法,DOX和ISL原料药在8h基本释放完全,而复方纳米结构脂质载体冻干针剂表现出良好的缓释性能,48h DOX与ISL的累计释放率63.87%和72.37%,含复合蛋白酶复方纳米结构脂质载体的缓释效果明显强于复方纳米结构脂质载体,48h DOX和ISL累计释放率分别为48.36%和54.36%,表明纳米结构脂质载体具有良好的缓释性能且呈酶响应性释放,释放行为释药曲线均符合Higuchi方程。<br> 结果显示,纳米结构脂质载体包载DOX和ISL后,可减慢药物的释放,避免突释,复合蛋白酶的加入加快释放剂量,说明含复合蛋白酶的纳米结构脂质载体具有一定缓释作用。建立了大鼠血浆中DOX和ISL的检测方法,药动学参数结果表明:复方纳米结构脂质载体经过非房室模型分析,复方纳米结构脂质载体中DOX的半衰期(t1/2z)为游离药的4.06倍,ISL的半衰期(t1/2z)为游离药的3.39倍。复方纳米结构脂质载体组的AUC和MRT也显著高于游离药物组(P<0.01),证明在同等给药量时,两药均有明显缓释效果和较高的生物量利用度。ISL与DOX采用不同比例联合应用对HeLa细胞的杀伤均呈相加或增强作用,当ISL:DOX药物质量浓度比为2:1时,细胞毒性最大;在相同时间点24h、48h、72h时,相同浓度药物条件下不同制剂组对宫颈癌对HeLa细胞的抑制率:DOX-ISL-NLC﹥DOX-NLC﹥Free-DOX,在72h最高抑制率分别可达98.30%、90.00%、77.00%。<br> 结论:应用熔融超声乳化法制备的复方纳米结构脂质载体操作简单、包封率较高、粒径均一、电位稳定、无异常毒性;体外释放缓慢,具有一定的缓释效果,无突释现象;且可显著延长大鼠的消除半衰期。复方纳米结构脂质载体对宫颈癌HeLa细胞的细胞毒性有一定的杀伤作用,且随时间和剂量依赖性增加。
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