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摘要在缺血性脑卒中中，梗死核心区与正常脑组织间存在一个过渡区域被称为缺血半暗带。低灌注的缺血半暗带存有濒临死亡的神经元，所以及早恢复缺血区域的血流、挽救半暗带的神经元是脑卒中治疗的重点。然而，再灌注还有助于活性氧的产生，从而激活免疫反应，导致神经炎症，加重脑组织损伤。脑缺血/再灌注后过度激活的小胶质细胞产生包括促炎因子在内的细胞毒性物质加重了神经元的损伤，受损或死亡的神经元释放“危险信号”又促进了小胶质细胞的激活。因此，抑制脑缺血/再灌注早期强烈的神经炎症是减轻缺血半暗带受损的关键。<br>　　核因子κB（NuclearfactorkappaB,NF-κB）调控数百个与炎症相关的基因，是神经炎症起始、扩大的重要分子，所以抑制NF-κB的过度激活可能是有效减轻神经炎症的策略之一。A20结合抑制NF-κB激活因子1（A20-bindinginhibitorofNF-κB1，ABIN1）作为NF-κB的负性调控者，是极具潜力的抗炎分子。然而，对ABIN1的认识还很少，目前尚无ABIN1在脑缺血/再灌注中的研究报道。<br>　　电针（Electroacupuncture,EA）是补充医学中一种最常见的治疗方式，已被众多研究支持具有脑保护及抗炎作用。虽然关于电针通过调控NF-κB发挥抗炎作用的研究日益增多，但电针对ABIN1的调控未见相关报道。因此，在本研究中我们首先建立大脑中动脉闭塞/再灌注（Middlecerebralarteryocclusion/reperfusion，MCAO/R）SD大鼠模型，检测ABIN1在大脑皮质缺血周边区的表达，并通过慢病毒介导抑制ABIN1表达，观察ABIN1沉默对大鼠神经功能缺损、脑梗死体积及神经炎症反应的影响。此外，给予MCAO/R大鼠电针治疗，并观察电针对ABIN1表达的调控，以及ABIN1沉默对电针发挥抗神经炎症、减轻脑缺血/再灌注损伤的影响。<br>　　第一部分ABIN1在局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质<br>　　缺血周边区的表达及影响<br>　　目的:建立局灶脑缺血/再灌注大鼠模型，检测ABIN1在大脑皮质缺血周边区的表达及对再灌注后神经炎性损伤的影响。<br>　　方法:建立MCAO/R大鼠模型，SD大鼠被随机分为六组：假手术组（sham）、脑缺血/再灌注组（MCAO/R）、脑缺血/再灌注+电针组（MCAO/R+EA）、脑缺血/再灌注+假电针组（MCAO/R+shamEA）、脑缺血/再灌注+空载组（MCAO/R+LV-Scramble）、脑缺血/再灌注+ABIN1沉默组（MCAO/R+LV-shABIN1），电针组给予每日一次的电针治疗。采用RT-qPCR、Westernblotting分别检测ABIN1mRNA及蛋白于不同时间点的表达；通过免疫荧光双标观察ABIN1的细胞定位；慢病毒介导沉默ABIN1的表达，应用改良神经功能缺损严重程度评分(ModifiedNeurologicalSeverityScore,mNSS)及改良贴纸实验（ModifiedSticky-TapeTest,MST）、TTC染色分别观察大鼠神经功能缺损、脑梗死体积，通过免疫荧光、ELISA分别检测小胶质细胞的激活及促炎因子肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocytechemotacticprotein-1，MCP-1）的表达，进一步探讨ABIN1在局灶脑缺血/再灌注神经炎性损伤中的作用。<br>　　结果:与sham组相比，MCAO/R组于12h至72hABIN1mRNA及蛋白表达增加（Plt;0.01），并于24h达峰值，但6h及7dABIN1的表达水平与sham组无明显差异（Pgt;0.05）；与MCAO/R组相比，电针<br>　　刺激促进大脑皮质缺血周边区ABIN1mRNA及蛋白于再灌注6h至7d的表达进一步增加（Plt;0.05），但假电针组与MCAO/R组相比无明显差异（Pgt;0.05）。免疫荧光结果进一步表明，再灌注后24h大脑皮质缺血周边区MCAO/R组较sham组ABIN1+细胞明显增加（Plt;0.01），MCAO/R+EA组较MCAO/R组ABIN1+细胞明显增加（Plt;0.01），假电针组与MCAO/R组相比无明显差异（Pgt;0.05）；ABIN1主要与神经元及小胶质细胞共标，其中ABIN1+Neun+细胞占ABIN1+细胞的70.22±1.71%，ABIN1+Iba-1+细胞占ABIN1+细胞的26.83±2.75%，在星形胶质细胞中几乎无ABIN1的表达。通过RT-qPCR及Westernblotting检测ABIN1的表达证明ABIN1基因被成功沉默。与MCAO/R组相比，MCAO/R+LV-shABIN1组再灌注后72h神经功能缺损增加（Plt;0.05）。局灶脑缺血/再灌注后72hTTC染色，sham组未见脑梗死，MCAO/R+LV-shABIN1组较MCAO/R组梗死体积增加（Plt;0.05）。ELISA结果表明，促炎因子（TNF-α、IL-1β、MCP-1）在MCAO/R组的浓度显著高于Sham组（Plt;0.01），ABIN1沉默后这些促炎因子表达进一步增加（Plt;0.01）。Iba-1免疫荧光染色观察再灌注后24h小胶质细胞，sham组小胶质细胞数量较少，多呈静息状态（分支状）；MCAO/R组大脑皮质缺血周边区小胶质细胞数目增加、胞体变大、突触减少，多呈激活状态。通过对小胶质细胞形态分析提示MCAO/R组较sham组分支末端数量及突起长度减少（Plt;0.01），ABIN1沉默使小胶质细胞分支末端数量及突起长度进一步减少（Plt;0.01）。<br>　　结论:再灌注后早期大鼠大脑皮层缺血周边区ABIN1表达上调，且电针进一步促进ABIN1的表达。神经元和小胶质细胞均为ABIN1<br>　　的主要细胞来源。ABIN1沉默使神经功能缺损加重、脑梗死体积扩大、小胶质细胞的激活及促炎因子的表达增加，提示ABIN1具有抗神经炎症的作用。<br>　　第二部分ABIN1在电针抗局灶脑缺血/再灌注后神经<br>　　炎症中的作用<br>　　目的：探讨ABIN1对电针发挥抗炎作用、抑制NF-κB信号通路的影响。<br>　　方法:建立MCAO/R大鼠模型，SD大鼠被随机分为四组：脑缺血/再灌注组（MCAO/R）、脑缺血/再灌注+电针组（MCAO/R+EA）、脑缺血/再灌注+电针+空载组（MCAO/R+EA+LV-Scramble）、脑缺血/再灌注+电针+ABIN1沉默组（MCAO/R+EA+LV-shABIN1），电针组给予每日一次的电针治疗。应用mNSS、MST、TTC染色观察各组大鼠神经功能缺损、脑梗死体积，通过免疫荧光、ELISA分别检测小胶质细胞激活及促炎因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达，探究ABIN1沉默对电针抑制神经炎性损伤的作用。采用Westernblotting检测再灌注后24h大脑皮质缺血周边区ABIN1、A20（又称为肿瘤坏死因子诱导蛋白3，TNFinducibleprotein3，TNFAIP3）、NF-κB抑制蛋白α（InhibitorkappaB，IκBα）、p-IκBα以及胞浆和胞核NF-κBp65蛋白的表达水平；通过免疫荧光观察NF-κBp65的核转位及A20与ABIN1的共定位，免疫共沉淀进一步检测ABIN1、A20及NF-κB必须调节因子(NF-κBessentialmodulator,NEMO)。<br>　　结果:与MCAO/R组相比，MCAO/R+EA组再灌注后72h神经功能缺损改善（Plt;0.05）。MCAO/R+EA+LV-shABIN1组与MCAO/R+EA组相比，局灶脑缺血/再灌注72h神经功能缺损增加（Plt;0.05）。再灌<br>　　注后72hTTC结果发现MCAO/R+EA组较MCAO/R组脑梗死体积显著减少（Plt;0.01），MCAO/R+EA+LV-shABIN1组较MCAO/R+EA组脑梗死体积增加（Plt;0.05）。再灌注后24h大脑皮质缺血周边区TNF-α、IL-1β及MCP-1的浓度：MCAO/R+EA组较MCAO/R组表达水平明显减少（均为Plt;0.01），MCAO/R+EA+LV-shABIN1组较MCAO/R+EA组表达水平增加（分别为Plt;0.01，Plt;0.05，Plt;0.05）。再灌注后24hIba-1免疫荧光染色观察到MCAO/R+EA组较MCAO/R组小胶质细胞分支末端数量及突起长度增加（均为Plt;0.01），MCAO/R+EA+LV-shABIN1组较MCAO/R+EA组分支末端数量及突起长度减少（Plt;0.05）。MCAO/R+EA组与MCAO/R相比A20及ABIN1蛋白表达水平增加（Plt;0.05），p-IκBα/IκBα显著减少（Plt;0.01），胞核/胞浆NF-κBp65显著降低（Plt;0.01）、核转位减少；MCAO/R+EA+LV-shABIN1组与MCAO/R+EA组相比ABIN1蛋白表达水平减少（Plt;0.01），p-IκBα/IκBα增加（Plt;0.05），胞核/胞浆NF-κBp65显著增加（Plt;0.01）、核转位增加。此外，再灌注后24h大脑皮质缺血周边区免疫荧光染色观察到ABIN1及A20共同表达于胞浆，免疫共沉淀结果进一步提示ABIN1和A20、NEMO相互结合。<br>　　结论:在局灶脑缺血/再灌注中，电针可通过抑制NF-κB活化来减轻神经炎症从而发挥脑保护作用，ABIN1沉默部分削弱了电针的作用，提示电针可能通过上调ABIN1的表达抑制NF-κB激活。此外，ABIN1可能协同A20抑制NF-κB的激活。