检索历史 清除

摘要目的：本研究旨在研究HORMA domain containing1（HORMAD1）其对三阴性乳腺癌（Triple Negative Breast Cancer，TNBC）多西他赛耐药的影响及其可能的作用机制。<br>　　方法：采用生物信息学等方法分析检测HORMAD1在乳腺癌数据库中的表达。收集经过新辅助化疗的TNBC患者的临床病理信息及组织样本，评估其病理缓解情况，IHC染色分析HORMAD1表达。分析HORMAD1表达与患者临床病理特征之间的关系。体外细胞实验中，采用分子生物学技术过表达及siRNA和慢病毒载体敲减TNBC细胞系中HORMAD1的表达。RT-PCR和western blot（WB）检测相关基因和蛋白变化情况。CCK-8法验证其对细胞增殖及药物敏感性的影响。流式细胞术检测不同处理对细胞周期、细胞凋亡和细胞内活性氧的影响。Caspase活性检测试剂盒检测加入化疗药诱导的凋亡标志物caspase3/8/9的变化。免疫荧光检测目的蛋白表达及定位。免疫沉淀法检测目的蛋白泛素化结合情况。<br>　　结果：生物信息学及数据库分析结果表明，HORMAD1仅在基底样型乳腺癌中存在表达差异，且特异性高表达在基底样型乳腺癌细胞系中。IHC检测发现，HORMAD1在新辅助化疗后有残余病灶的TNBC组织中表达率为21.1%(23/109)。且其表达与TNBC患者预后无关。<br>　　在体外实验中，采用siRNA敲减HORMAD1不影响TNBC细胞的增殖，周期和凋亡等生物学行为。但WB检测发现，敲减HORMAD1后伴随自噬标志物P62的显著降低和Beclin1的显著增加。过表达HORMAD1则伴随着P62蛋白的显著增加。TNBC细胞内敲减HORMAD1表达可以增强多西他赛（docetaxel）的药物敏感性。DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂2-脱氧胞苷可以诱导MDA-MB-231细胞内源性高表达HORMAD1，并且降低docetaxel对MDA-MB-231细胞的细胞毒性。流式细胞仪检测发现，加入docetaxel后，相比于对照组，敲低HORMAD1的MDA-MB-436中细胞凋亡显著增加。WB检测发现加入docetaxel后HORMAD1敲低组抗凋亡蛋白BCL2显著降低。周期检测发现，在TNBC细胞内加入docetaxel作用后，HORMAD1敲低组细胞发生G0/G1期阻滞，S期降低。并且加入docetaxel后，HORMAD1敲低组细胞增殖显著低于对照组。同时，敲低HORMAD1组细胞内活性氧更多，且产生的活性caspase3/8/9均高于对照组。<br>　　机制探究发现，过表达HORMAD1增加docetaxel诱导的MDA-MB-231细胞早期凋亡，和自噬抑制剂3MA增加docetaxel诱导的MDA-MB-436细胞早期凋亡比例接近。有趣的是，虽然3MA能增强docetaxel诱导的细胞活性降低，但随着docetaxel浓度增加，这种增敏作用减弱。并且，3MA也不能进一步增加HORMAD1敲低组docetaxel诱导的细胞损伤。同时，TNBC细胞内加入docetaxel后，HORMAD1敲低组的DNA损伤标志物γH2AX显著增加，DNA损伤修复标志物RAD51显著降低。Hoechst染色结果发现，加入docetaxel作用后，HORMAD1敲减组内细胞核碎裂比例更高。<br>　　进一步研究发现，TNBC细胞内采用慢病毒感染加puromycin筛选持续敲减HORMAD1后，细胞增殖受到抑制，并出现细胞周期阻滞，并且出现衰老细胞比例增加。WB检测发现衰老相关蛋白标志物pRB，P27等均显著增加。同时，siRNA瞬时敲减HORMAD1也发现TNBC衰老细胞比例增加。RT-PCR检测发现，敲减HORMAD1后不影响P27基因表达，但WB检测发现敲减HORMAD1后P27蛋白表达水平显著增加，反之亦然。回复实验证实，与单独HORMAD1敲减组相比，敲减HORMAD1的同时敲减P27能够降低衰老细胞比例。放线菌酮抑制蛋白合成实验证实，TNBC细胞内敲减HORMAD1后P27蛋白降解减缓，反之亦然。MG132抑制蛋白降解实验证实，TNBC细胞内过表达HORMAD1后，P27蛋白降解受到抑制。蛋白免疫沉淀实验证实，TNBC细胞内过表达HORMAD1后，P27蛋白泛素化增加。<br>　　结论：HORMAD1仅在TNBC亚型中高表达。TNBC细胞内HORMAD1通过促进P27蛋白泛素化降解而负调控P27的表达。HORMAD1抑制肿瘤细胞衰老和促进DNA损伤耐受可能是其docetaxel耐药的主要原因。