检索历史 清除

摘要背景<br>　　卵巢癌作为女性三大恶性肿瘤之一，其致死率排于首位，以铂类为基础的一线化疗方案，在早期具有较高的反应性，但将逐渐产生的耐药性，导致治疗失败。DNA修复及生存通路的激活在DDP耐药中发挥着重要作用，然而目前对卵巢癌顺铂(DDP)耐药的研究仍不全面。因此研究耐药的分子机制，可为克服顺铂耐药提供新的靶点。<br>　　本课题组经生物信息学分析发现NTNG1在卵巢癌DDP耐药细胞中高表达。NTNG1(netrinG1)通过与细胞膜表面受体调节细胞排斥、吸引及组织粘附。其表达异常与肿瘤的发生与复发密切相关，但在卵巢癌中的作用及机制并不清楚。<br>　　AXL是酪氨酸受体激酶，通过与GAS6(growtharrest-specific6)结合能激活下游的ERK和Akt信号通路，在肿瘤的发生、发展及耐药中发挥着重要作用。研究表明AXL在卵巢癌DDP耐药中发挥着作用，但其具体调节机制尚未阐明。<br>　　经生物信息学分析预测NTNG1与GAS6存在互相作用，故推测NTNG1能调节GAS6/AXL/Akt信号通路，促进卵巢癌DDP耐药。本研究探讨NTNG1在上皮性卵巢癌DDP耐药中的作用并分析其作用机制。<br>　　第一部分NTNG1在卵巢癌组织的表达<br>　　目的<br>　　检测NTNG1在上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中的表达水平，分析其在DDP耐药、敏感肿瘤组织中的表达差异及与预后的关系。<br>　　方法<br>　　1.通过生物信息学分析NTNG1在DDP敏感及耐药卵巢癌细胞中的表达差异。<br>　　2.收集卵巢癌患者卵巢肿瘤组织切片及临床资料。<br>　　3.免疫组化法(IHC)检测NTNG1在卵巢肿瘤组织中的表达。<br>　　4.比较NTNG1在敏感及耐药患者中表达的差异，分析肿瘤组织中NTNG1表达水平与患者生存时间的关系。<br>　　结果<br>　　1.数据集GSE45553和GSE7393分析显示NTNG1在耐药细胞中的表达水平高于敏感细胞。<br>　　2.NTNG1在耐药患者肿瘤组织中表达较敏感患者肿瘤组织中高(plt;0.05)。<br>　　3.NTNG1表达升高，患者无进展生存期(PFS)缩短(plt;0.05),无顺铂生存期(PFD)缩短(plt;0.05)。<br>　　结论<br>　　NTNG1在DDP耐药卵巢癌组织中表达较敏感组织升高；NTNG1表达升高预后不良，预后不良，生存期缩短；NTNG1具有促进卵巢癌DDP耐药的作用。<br>　　第二部分NTNG1促进卵巢癌细胞顺铂耐药<br>　　目的<br>　　探讨过表达或沉默NTNG1表达后对卵巢癌DDP耐药的影响及其作用机制。<br>　　方法<br>　　1.检测NTNG1在DDP敏感、耐药细胞的表达水平。<br>　　2.下调或上调NTNG1，检测DDP作用后细胞凋亡、存活率、DNA损伤/修复能力。<br>　　3.检测NTNG1对GAS6/AXL/Akt信号通路的激活作用。<br>　　结果<br>　　1.NTNG1在DDP耐药细胞SKOV3/DDP中的表达高于敏感细胞SKOV3，DDP可诱导NTNG1表达。故在SKOV3过表达NTNG1，而在SKOV3/DDP中沉默NTNG1。<br>　　2.SKOV3细胞过表达NTNG1，经DDP作用后，细胞存活率升高，凋亡细胞减少。SKOV3/DDP细胞敲低NTNG1，经DDP治疗后，细胞存活率降低，凋亡细胞增多。<br>　　3.DDP诱导γ-H2A.X和RAD51表达升高。SKOV3细胞过表达NTNG1，经DDP作用后，细胞DNA损伤标记物γ-H2A.X焦点减少，RAD51表达升高。SKOV3/DDP细胞敲低NTNG1，经DDP作用后，γ-H2A.X焦点增多，RAD51表达降低。<br>　　4.DDP诱导p-AXL及p-Akt升高。上调NTNG1，SKOV3细胞p-AXL、p-Akt升高。下调NTNG1，SKOV3/DDP细胞p-AXL、p-Akt表达降低。免疫共沉淀结果显示NTNG1能直接结合GAS6/AXL。<br>　　结论<br>　　NTNG1能通过结合GAS6/AXL调节AXL、Akt的磷酸化，激活AXL/Akt信号通路，提高RAD51的表达促进DNA损伤修复，进而促进卵巢癌细胞对DDP的耐药性。<br>　　第三部分NTNG1体内调节卵巢癌顺铂耐药<br>　　目的<br>　　体内考察NTNG1能否调节DNA对卵巢癌细胞的抗肿瘤效力。<br>　　方法<br>　　1.以上调、下调NTNG1卵巢癌细胞构建裸鼠皮下瘤模型，以DDP治疗。<br>　　2.比较移植瘤体积及质量的差异。<br>　　3.IHC检测NTNG1、RAD51在皮下瘤组织中的表达。<br>　　结果<br>　　1.下调或下调NTNG1后体内肿瘤生长无明显差异。<br>　　2.上调NTNG1，SKOV3肿瘤，NTNG1+DDP组体积、质量均大于NC+DDP。下调NTNG1，SKOV3/DDP肿瘤，shNTNG1+DDP组体积、质量均小于shNC+DDP组。<br>　　3.DDP诱导肿瘤组织中NTNG1及RAD51的表达。SKOV3肿瘤，上调NTNG1升高RAD51在肿瘤组织中的表达。SKOV3/DDP肿瘤，下调NTNG1降低RAD51的表达。<br>　　结论<br>　　NTNG1可通过调节DNA修复能力而影响卵巢肿瘤对DDP的体内疗效。