检索历史 清除

摘要背景与目的：<br>　　自身免疫性肝炎（Autoimmunehepatitis，AIH）是一种自身免疫失衡导致肝细胞损害的慢性进行性肝脏炎症性疾病，其特征是血清转氨酶升高、自身抗体阳性、高γ球蛋白血症（IgG），组织学以界面性肝炎以及点灶状坏死，伴有浆细胞淋巴细胞浸润为特点。AIH的发病机制尚不清楚，但有证据表明，遗传、环境、免疫以及药物等均与其相关，而凋亡被认为是AIH肝细胞死亡的主要机制。AIH的最终结局可能是肝损伤、失代偿性肝硬化或肝癌。虽然终身免疫抑制治疗可部分缓解症状，减缓疾病进展，但终末期患者仍需肝移植。<br>　　MicroRNAs是一类长度为18-24bp的内源性非编码小RNA，在转录后水平负向调控靶基因的表达。MiRNAs可以参与多种生理病理过程，包括细胞增殖、分化和凋亡。MiR-431-5p在人肝细胞癌和胰腺癌中均抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡。在坏死性小肠结肠炎中，miRNA-431通过靶向调节FOXO1降低Caco-2细胞的增殖并增加其凋亡，但miRNA-431在AIH进展中的作用尚不清楚。<br>　　Kruppel-likefactor15（KLF15）是属于KLF家族蛋白的一种转录调节因子，在肾、肝、心等多个组织中表达，参与细胞凋亡、分化和增殖过程。既往研究表明，KLF15通过直接靶向NFATc1或通过阻断足细胞中的ERK/p38MAPK通路抑制细胞凋亡。此外，KLF15的缺乏以p53依赖的方式增加了血管平滑肌细胞的凋亡。然而，抑制miRNA-431-5p通过靶向AIH中的KLF15减少肝细胞凋亡和改善肝功能的机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨miRNA-431-5p在肝细胞凋亡过程中通过靶向KLF15调控p53信号通路的作用。<br>　　方法：<br>　　58只雄性C57BL/6小鼠，随机选择10只在肝脏灌注后取肝，冰上匀浆。150g离心10分钟后，收集上清液，100000g离心1小时，其上清液为S100。上清液经AmiconUltra-15过滤器浓缩后，用90cmCL-6BSepharose柱分离蛋白，得到3个蛋白峰。本研究将新鲜制备的第一峰S100抗原以0.5~2mg/mL的浓度乳化于等体积的完全弗氏佐剂中，分别于第1天和第7天腹腔注射于AIH模型组小鼠（n=24），对照组注射等量生理盐水（n=24）。第14天，对照组和AIH模型组随机分为3个亚组（n=8），分别经尾静脉注射AAV9-miR-431-5p-GFP、AAV9-miR-431-5p-Spongoff-GFP和AAV9-阴性对照-GFP（1011pfu/ml）。第35天，用水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血法取血。血样在4℃下3000rpm离心15分钟，取上层血清进行生化分析。快速肝脏灌注后，取部分小鼠肝组织用4%多聚甲醛固定，用于组织切片病理检测。其余样品分装保存在-80℃，用于PCR及WB检测。<br>　　正常小鼠肝细胞系AML12在添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物、1%ITS和40ng/mL地塞米松的完整DMEM/F12培养基中培养。为了上调或下调miR-431-5p和KLF15的表达，转染miR-431-5p模拟物、抑制剂（50nM）和KLF15-siRNA（50nM）或相应的对照。6小时后更换培养液，用1μg/mlLPS刺激细胞24小时，PBS为对照。然后收集细胞进行后续实验。<br>　　使用GraphPadPrism8.0软件进行统计分析。组间差异分析采用t检验或单因素方差分析(one-wayANOVA)。所有数据均以平均数±标准误表示。p＜0.05代表有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.用S100或LPS在体内或体外成功建立AIH模型：S100组小鼠ALT、AST和IgG水平（226.80±24.24、499.80±23.52、10.27±0.63）明显高于对照组（41.20±5.64、119.80±11.42、2.20±0.09），差异均有统计学意义（p＜0.05）。肝脏病理改变表现为界面性肝炎、点灶状坏死、淋巴细胞和浆细胞浸润。1ug/mLLPS刺激AML12细胞24h后，IL-1β、IL-6（3.02±0.73、3.92±0.11）均升高（p＜0.05）。2.AIH中miR-431-5p升高伴KLF15降低：S100组小鼠miR-431-5p水平（1.90±0.08）较对照组升高，KLF15水平（0.31±0.01）下降（p均＜0.05）。AML12细胞经LPS刺激24小时后，miR-431-5p水平（2.66±0.07）升高，KLF15水平（0.6±0.04）降低。<br>　　3.AIH小鼠肝细胞凋亡增加，抑制miR-431-5p降低细胞凋亡：S100联合AAV9-miR-431-5p-Spongoff-GFP治疗小鼠Cleavedcaspase-3和Bax/Bcl-2水平（1.51±0.15、1.04±0.16）较S100组（4.05±0.82、1.54±0.24）小鼠明显下降（p＜0.05），miR-431-5p抑制剂也能减低LPS诱导的AML12细胞凋亡。<br>　　4.KLF15是miR-431-5p的直接靶标，且KLF15调控p53：MiR-431-5p模拟物与野生型KLF15共转染细胞后，荧光素酶活性明显低于阴性对照组（0.66±0.01）（p＜0.05）。此外，KLF15的抑制伴随着p53水平的升高，促进凋亡。而沉默KLF15可阻断PFTβ（p53特异性抑制剂）对p53的抑制作用。<br>　　5.MiR-431-5p通过KLF15/p53轴调节细胞凋亡：MiR-431-5p低表达时，KLF15在转录和翻译水平均升高，p53水平下调，减轻肝细胞凋亡。MiR-431-5p抑制剂与si-KLF15共转染时，p53表达恢复，加重凋亡与肝损伤。<br>　　结论：<br>　　我们的研究提示，抑制miR-431-5p可能通过调节肝细胞中KLF15/p53的表达来减轻S100诱导和LPS刺激引起的肝细胞损伤，这可能是AIH生物治疗的一个新靶点。