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摘要背景和目的：<br>　　自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis,AIH)是一种慢性进行性炎性肝病，主要特征为血清转氨酶和丙种球蛋白水平异常升高、多种自身抗体阳性，肝组织出现界面性肝炎、炎症细胞浸润等。当前，治疗AIH最常用的药物是糖皮质激素联合免疫抑制剂，其抗炎和免疫抑制效果强，但持续长时间用药毒副作用大，部分患者难以耐受或应答欠佳，因此探索新的药物和治疗方案迫在眉睫。近年来，大批的基础研究致力于中药天然产物对AIH的防治疗效和具体分子机制，中草药在改善AIH的症状和延缓疾病进展方面表现出较好的疗效，前景可期。牡荆素属于黄酮类化合物，现代药理研究表明其具有多种药理活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功能。近年来研究证实，牡荆素可以通过不同的作用机制对慢性肝病起到治疗作用，而关于其在自身免疫性肝炎中的作用，目前鲜有报道，且分子机制尚不明确。因此，本研究的目的是通过同种异体肝抗原S100建立小鼠自身免疫性肝炎模型，研究牡荆素治疗自身免疫性肝炎的效果及其机制。本论文的开展进一步丰富了AIH相关的基础研究，为AIH的治疗提供新的思路和理论依据。<br>　　方法：<br>　　1.通过小鼠体内实验研究牡荆素对自身免疫性肝炎的治疗作用及其对AMPK/GSK-3β/Nrf2信号通路影响。4-6周龄雄性C57BL/6小鼠用随机数字法挑选10只小鼠用于同种异体肝抗原S100的提取。再随机分出6只为正常对照组（Control），其余18只于实验第1天和第7天两次腹腔注射同种异体抗原S100与弗氏完全佐剂混悬液建立实验性自身免疫性肝炎模型（EAH）。模型小鼠随机分为模型组、低剂量牡荆素治疗组和高剂量牡荆素治疗组。自腹腔注射S100的第1天起，分别给予各治疗组小鼠不同剂量的牡荆素(1.5mg/kg/d和5mg/kg/d)灌胃30天，正常对照组和模型组给予相同时间的生理盐水灌胃。实验第31天，全部小鼠用10%水合氯醛进行全身麻醉后处死。摘下眼球取血，用于检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase,AST）水平；苏木精伊红染色（HE）切片观察肝脏组织病理变化；免疫组化方法观察肝脏CD4+T阳性细胞表达情况；利用特定试剂盒测定肝组织氧化应激指标超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的含量；ELISA法测定肝脏组织细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达；Westernblot检测肝脏组织内凋亡相关蛋白Cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2的表达及通路相关蛋白AMPK、GSK-3β、Nrf2、HO-1活化情况。<br>　　2.通过体外细胞实验研究牡荆素保护肝细胞的作用及AMPK/GSK-3β/Nrf2信号通路在其中发挥的作用。CCK-8法分别测定24小时和48小时不同浓度的牡荆素对AML12细胞（小鼠正常肝细胞）活力的影响；利用D-GalN（44μg/ml）和LPS（100ng/ml）建立AML12细胞损伤模型，为验证牡荆素对肝细胞的保护作用，我们将细胞分为四组：正常对照组（control）、模型组（D-GalN/LPS）、低剂量治疗组（牡荆素12.5μM）和高剂量治疗组（牡荆素50μM），流式细胞术测定细胞凋亡率，Westernblot测定Cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达变化及qRT-PCR测定细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。接着我们将细胞再分为四组：正常对照组（control）、模型组（D-GalN/LPS）、正常细胞低剂量处理组（牡荆素12.5μM）和正常细胞高剂量处理组（牡荆素50μM），Westernblot法检测牡荆素对AMPK/GSK-3β/Nrf2通路活化的影响。然后在D-GalN/LPS刺激前，分别给予siRNA敲低Nrf2，CompoundC抑制AMPK，观察不同处理前后，牡荆素对通路蛋白活化的影响。最后利用分子对接软件预测了牡荆素与AMPK蛋白可能的结合方式。<br>　　结果：<br>　　（1）腹腔注射S100导致小鼠体内ALT、AST水平上升，HE结果提示肝组织中浸润了大量炎症相关细胞，部分细胞肿胀坏死，结构紊乱；免疫组化提示CD4+T细胞浸润；肝组织内细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显增加；肝组织匀浆检测SOD、T-AOC明显降低，而MDA和MPO明显升高；WB提示促凋亡因子Cleavedcaspase-3和Bax升高，抗凋亡因子Bcl-2表达明显下降，而且p-AMPK、p-GSK-3β及Nrf2和HO-1的表达均有显著下降。而牡荆素治疗组可以有效逆转上述因子的表达，以其中高浓度组的效果更为显著。<br>　　（2）D-GalN/LPS刺激体外培养的AML12细胞后，流式细胞术结果显示细胞凋亡率较对照组明显升高，牡荆素可抑制凋亡。Westernblot结果提示，模型组细胞中促凋亡因子Cleavedcaspase-3和Bax升高，抗凋亡因子Bcl-2表达明显下降；qRT-PCR结果提示炎症模型组细胞中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表达明显升高，以上这些变化均能被牡荆素逆转。而且我们发现，牡荆素可以促进AML12细胞中p-AMPK、p-GSK-3β、Nrf2和HO-1的表达上调，及Nrf2的核转位。敲低AML12细胞中的Nrf2后，牡荆素对受损细胞中Nrf2、HO-1的上调被明显削弱；AML12细胞经AMPK抑制剂CompoundC预处理后，牡荆素对受损细胞中p-AMPK、p-GSK-3β、HO-1及核内Nrf2的上调作用也同样被明显抑制。同时分子对接提示，牡荆素分子能很好地结合在AMPK蛋白的活性口袋，并和结合位点的V96以及E100形成四个氢键，此外还存在一些疏水相互作用，这些是促进牡荆素分子结合到活性位点的关键因素。<br>　　结论：<br>　　牡荆素对S100诱导的小鼠自身免疫性肝炎具有显著治疗作用，可明显减轻肝脏炎症反应，改善肝功能，降低氧化应激反应及炎症因子释放，提示牡荆素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化作用。牡荆素通过激活AMPK/GSK-3β/Nrf2通路，诱导其下游信号分子HO-1的表达进而缓解细胞损伤及凋亡，最终发挥保护肝细胞作用。