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摘要目的：证实细胞自噬及其调控通路PTEN-PI3K/Akt/mTOR参与Wnt经典通路诱导小鼠骨髓来源间充质干细胞（micebonemarrowderivedmesenchymalstemcells,mMSCs）向肺泡上皮（typeⅡalveolarepithelial,ATⅡ）细胞的分化。<br>　　方法：小鼠骨髓来源间充质干细胞（micebonemarrowderivedmesenchymalstemcells,mMSCs）及小鼠肺上皮细胞（Murinelungepithelial-12，MLE-12）结合小气道培养基（SAGM）共培养构建体外诱导MSC向肺上皮细胞分化的模型,通过LiCl或DKK-1分别激活或抑制经典Wnt通路，实验分组如下：a.MSC组：MSC单独培养、b.MSC+MLE组：MSC与MLE-12共培养、c.MSC+MLE+LiCl组：MSC与MLE-12共培养并给予4mMLiCl激活经典Wnt通路、d.MSC+MLE+DKK-1组：MSC与MLE-12共培养并给予200ng/mlDKK-1抑制Wnt经典通路。通过Westernblot法检测诱导分化的第7天Ⅱ型肺泡上皮细胞标志表面活性蛋白（surfactantprotein,SP）C评估MSC向II型肺泡上皮细胞分化情况，并检测诱导分化第1,3,7天自噬相关蛋白（LC3B及Beclin-l）的表达以及诱导分化第7天PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路相关信号分子（PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR）的表达明确Wnt经典通路诱导MSC向肺泡上皮细胞分化过程中对细胞自噬及自噬调控通路PTEN-PI3K/Akt/mTOR的影响。为进一步明确自噬参与Wnt经典通路诱导间充质干细胞向肺泡上皮细胞分化，分别通过羟氯喹或rapamycin抑制或激活细胞自噬，实验分组如下：a.MSC+MLE组：MSC与MLE-12共培养；b.MSC+MLE+LiCl组：MSC与MLE-12共培养并给予4mMLiCl激活Wnt经典通路；c.MSC+MLE+LiCl+羟氯喹组：MSC与MLE-12共培养并给予4mMLiCl激活Wnt经典通路及50μM羟氯喹抑制自噬；d.MSC+MLE+DKK-1组：MSC与MLE-12共培养并给予200ng/mlDKK-1抑制Wnt经典通路；e.MSC+MLE+DKK-1+rapamycin组：MSC与MLE-12共培养并给予200ng/mlDKK-1抑制Wnt经典通路及1uMrapamycin激活自噬。诱导MSC向肺上皮细胞分化后的第7天通过Westernblot法检测SP-C及自噬相关蛋白Beclin-l。<br>　　结果：<br>　　（1）通过Westernblot法检测诱导分化第7天SP-C的表达发现：MSC与MLE共培养较MSC单独培养的SP-C表达增加[(1.28±0.46)vs（0.95±0.44），p＜0.05];与MSC单独培养及与MSC、MLE-12共培养相比较，共培养中加入LiCl时SP-C表达增加[MSC:（1.40±0.91）vs(0.95±0.44)，p＜0.05;MSC+MLE:（1.40±0.91）vs(1.28±0.46)，p＜0.05]；与MSC单独培养,与MLE-12共培养及与共培养中加入4mMLiCl相比，加入DKK-1后SP-C表达下降[MSC+MLE:（1.19±0.18）vs1.28±0.46，p＜0.05;MSC+MLE+LiCl:（1.19±0.18）vs（1.40±0.91），p＜0.05]。结果表明，LiCl激活经典Wnt通路促进mMSC向肺上皮细胞分化，抑制Wnt通路减少MSC向肺上皮细胞分化。<br>　　（2）通过Westernblot法检测诱导分化第1,3,7天自噬相关蛋白（LC3B及Beclin-l）的表达发现：与MSC单独培养相比较，共培养中加入LiCl时Beclin-l、LC3-II/I表达增加[Beclin-l，1d：（2.27±0.14）vs(1.22±0.19);3d:（3.23±0.20）vs(1.96±0.13);7d:（4.73±0.37）vs(3.14±0.12),p＜0.05;LC3-II/I,1d:（2.49±0.09）vs（1.24±0.10），p＜0.05;3d:（2.3±0.17）vs（1.22±0.09），p＜0.05;7d:（3.02±0.12）vs（1.49±0.04），p＜0.05;];与MSC、MLE-12共培养相比较，共培养中加入LiCl时Beclin-l、LC3-II/I表达仍然增加[Beclin-l，1d：（2.27±0.14）vs(1.94±0.57);3d:（3.23±0.20）vs(2.67±0.16);7d（4.73±0.37）vs(4.06±0.18),p＜0.05];[LC3-II/I，1d:（2.49±0.09）vs（2.00±0.03），p＜0.05;3d:（2.3±0.17）vs（1.84±0.02），p＜0.05;7d:（3.02±0.12）vs（2.47±0.13），p＜0.05]，而加入DKK-1后与MSC、MLE-12共培养相比较，加入DKK-1后Beclin-l、LC3-II/I表达下降[Beclin-l，1d：（1.63±0.16）vs(1.94±0.57);3d:（2.36±0.76）vs(2.67±0.16);7d（3.71±0.10）vs(4.06±0.18),p＜0.05];[LC3-II/I,1d:（1.67±0.10）vs（2.00±0.03），p＜0.05;3d:（1.49±0.07）vs（1.84±0.02），p＜0.05;7d:（1.96±0.07）vs（2.47±0.13），p＜0.05];与加入LiCl比较Beclin-l、LC3-II/I表达下降[Beclin-l，1d：（1.63±0.16）vs（2.27±0.14）;3d:（2.36±0.76）vs（3.23±0.20）;7d（3.71±0.10）vs（4.73±0.37）,p＜0.05];[LC3-II/I,1d:（1.67±0.10）vs（2.49±0.09），p＜0.05;3d:（1.49±0.07）vs（2.3±0.17），p＜0.05;7d:（1.96±0.07）vs（3.02±0.12），p＜0.05]。<br>　　（3）通过Westernblot法检测诱导分化第1,3,7天PTEN-PI3K/Akt/mTOR通路相关信号分子，发现激活经典Wnt通路使PTEN蛋白表达水平升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表达下降（p＜0.05），而DKK-1组结果为：抑制经典Wnt通路MSC的PTEN蛋白表达水平下调。p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表达增加（p＜0.05）。表明激活经典Wnt通路时自噬调控通路PTEN-PI3K/Akt/mTOR信号分子激活。<br>　　（4）MSC+MLE-12+4mMLiCl+羟氯喹组发现自噬相关蛋白BECLIN及SPC相较于MSC+MLE-12+4mMLiCl组减少[BECLIN:（0.95±0.26）vs（1.18±0.29）,p＜0.05;SP-C:（1.07±0.07）vs（1.34±0.08）,p＜0.05]，表明羟氯喹抑制自噬，同时抑制MSC向肺上皮细胞的分化。同时MSC+MLE-12+200ng/mlDKK-1+rapamycin组发现自噬相关蛋白及SPC相较于MSC+MLE-12+200ng/mlDKK-1组表达增加[BECLIN:（1.19±0.18）vs（0.76±0.15）,p＜0.05;SP-C:（0.99±0.07）vs（0.73±0.03）,p＜0.05]，表明rapamycin激活自噬的同时促进MSC向肺上皮细胞分化。<br>　　结论：<br>　　（1）激活经典Wnt通路促进MSC向肺上皮细胞分化。<br>　　（2）激活经典Wnt通路增加MSC自噬水平及自噬调控通路PTEN-PI3K/Akt/mTOR信号分子的激活。<br>　　（3）抑制细胞自噬能减少Wnt经典通路激活诱导的MSC成肺泡上皮细胞分化，提示经典Wnt通路可能通过调控自噬促进MSC分化为肺泡上皮细胞。