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摘要本文将从投射至SLD的orexin神经元群的活动特征和功能及神经环路机制等方面进行探索。利用CTB逆行示踪技术、神经元激活标记c-Fos免疫组化技术和光纤钙成像技术观察该神经元亚群在睡眠/觉醒期间的主要活动特征。然后采用一系列行为学手段来探索该特定通路的功能意义，进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒周期的联系。最后结合新型逆行/顺行病毒追踪技术，对与这些神经元存在直接神经联系的上下游脑区进行系统标定，初步研究该神经元亚群的神经环路机制。<br>　　现将相关结果阐述如下：<br>　　1.蓝斑底核投射的orexin神经元活动特征的研究<br>　　（1）LH存在一群特异性支配SLD的orexin神经元<br>　　本文首先研究了投射至SLD脑区的orexin神经元的数量及分布模式等是否具有其独特性。利用CTB逆行示踪剂追踪到有7.1±0.8%的orexin神经元投射到促REM睡眠核团SLD，并且有15.2±2.1%的orexin神经元投射到促觉醒核团LC。此外，通过统计分析发现分别投射到SLD和LC的orexin神经元仅有1.9±0.3%的重叠（n=6rats,n=3902orexin neurons）。上述结果表明确实存在一部分orexin神经元能够特异性投射至SLD，尽管SLD与LC相邻，但根据其下游投射靶点乃至功能的不同能够在下丘脑区域区分出不同的orexin神经元亚群。<br>　　接下来为了进一步探究分别投射到SLD和LC的orexin神经元分布模式是否具有解剖位置上的特异性，根据大鼠立体定位脑图谱按照由尾端至头端的纵轴方向（AP:-2.30~-3.80mm），在每隔200μm的6张冠状脑片上统计orexin神经元的分布数量及位置。结果发现投射到SLD的orexin神经元和投射到LC的orexin神经元与整体orexin神经元分布模式均一致，混杂分布于下丘脑中，且分布数量均是从尾端至头端由少逐渐增多再减少。上述结果提示在SLD区域以及LC区域逆行追踪所标记的orexin神经元在下丘脑中为散在分布，而非特异性分布于特定区域位置。<br>　　（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群显示REM睡眠相关激活<br>　　为了进一步明确特异性投射至SLD的orexin神经元亚群是否在睡眠/觉醒周期中具有某种活动特征进而为其下游投射靶点提供驱动力，我们对SLD区域注射CTB逆行示踪剂的大鼠进行72h的REM睡眠剥夺。第一次REM睡眠出现的2.5h后，立即对大鼠进行灌注，进行c-Fos免疫荧光染色。发现整体orexin神经元在睡眠剥夺组与对照组中的c-Fos表达量并无显著差异（control:7.1±1.3%,n=4rats;RSD:6.0±0.6%,n=7rats;P=0.435），而特异性投射至SLD的orexin神经元群在睡眠剥夺后的恢复期中c-Fos表达量显著增加（control:6.8±2.8%,n=4rats;RSD:28.2±2.9%,n=7rats;P=9.221×10?4）。这部分结果表明不同于整体orexin神经元的活动特点，特异性投射至SLD的orexin神经元群能够在丰富的REM睡眠中表现出更强的活性。<br>　　（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群在REM睡眠期间钙信号增强<br>　　为了更加精确地探索特异性投射至SLD的orexin神经元在自然生理状态下的睡眠/觉醒周期中的活动特点，在orexin-Cre转基因小鼠的SLD脑区定位注射逆行转染的病毒AAV-retro-Enf1α-DIO-GCaMP6s-WPRE-pA，使得特异性投射至SLD的orexin神经元标记上绿色荧光。采用光纤钙成像技术记录自由活动小鼠脑内这部分orexin神经元的钙信号强度变化，结果显示特异性投射至SLD的orexin神经元在REM睡眠期间具有明显的荧光变化（ΔF/F:0.46±0.05%），且显著高于NREM睡眠期间（ΔF/F:0.07±0.02%），而在觉醒期前荧光变化（ΔF/F:1.27±0.17%）呈现出增高的趋势（n=4mice,one-way ANOVA;F(2,9)=36.146;P=0.5×10?4;post hoc LSD comparison test;PREM vs NREM=0.0236;PREM vswakefulness=3.27×10?4;PNREM vs wakefulness=0.16×10?4）。上述结果再次明确，不同于以往所研究的仅在觉醒期间发生激活的orexin神经元，我们所关注的这群特异性投射至SLD的orexin神经元能够在整个REM睡眠过程中处于活跃状态。<br>　　2.蓝斑底核投射的orexin神经元功能及环路特征的初步研究<br>　　（1）特异性支配SLD的orexin神经元亚群调控REM睡眠稳定<br>　　值得注意的是具有如此独特性的这部分orexin神经元在整体睡眠/觉醒调控中到底发挥了什么样的功能呢。我们接下来利用了光遗传学技术在单次REM睡眠中光抑制投射至SLD的orexin能纤维末梢，发现小鼠REM睡眠期间theta能量减少约7.4%（n=9mice,P=0.0325），并且平均REM睡眠片段时程显著缩短18.2%（n=9mice,P=0.0363），而其肌电并未发生明显变化（n=9mice,P=0.32）。进一步采用taCasp3病毒特异性长时程损毁投射至SLD的orexin神经元亚群。结果发现，与对照组小鼠相比，taCasp3组小鼠在REM睡眠期间肌电显著升高（ncontrol=11mice,ntaCasp3=8mice,control:0.93±0.01,taCasp3:1.04±0.01;two-sided unpaired t-test;P=0.09×10-4）。进一步小鼠采取24h REM睡眠剥夺，与对照组小鼠相比，taCasp3组小鼠在rebound期间出现间断的REM睡眠，主要表现在持续维持一段REM睡眠的能力明显减弱（ncontrol=10mice,ntaCasp3=10mice,wildtype:1.77±0.14;taCasp3:1.34±0.11;two-sided unpaired t-test;P=0.028），并且出现REM睡眠片段数量增多的现象（wildtype:0.99±0.07;taCasp3:1.38±0.17;two-sided unpaired t-test;P=0.047）。故长时间缺失此通路对REM睡眠稳态具有显著影响，会使得REM睡眠恢复能力有所减弱。综上所述，这部分实验结果表明SLD中的orexin能信号或特异性投射至SLD的orexin神经元的缺失均对REM睡眠的稳态调控具有明显影响，进一步明确了该条特异性通路能够稳定REM睡眠。<br>　　（2）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的下游投射靶点<br>　　为进一步明确这群投射至SLD的orexin神经元亚群在睡眠/觉醒调控中是通过驱动哪些下游投射靶点进而发挥稳定REM睡眠的作用。故采用orexin-Cre转基因小鼠，在其SLD区域进行立体定位注射，将特异性投射至SLD的orexin神经元表达上红色荧光蛋白，通过荧光蛋白的免疫荧光染色和显微镜下的纤维成像，可系统分析其直接投射的下游靶点。结果发现该orexin神经元亚群仅仅只投射至SLD和与其相邻的LC，在其它REM睡眠相关脑区PNO、LDT以及觉醒相关脑区PVT均不发送纤维投射（n=2mice）。该实验结果也与第一部分实验结果相呼应，更加明确了投射至SLD的orexin神经元亚群的独特性。<br>　　（3）特异性支配SLD的orexin神经元亚群的上游全脑输入<br>　　上述实验结果已表明特异性支配SLD的orexin神经元几乎是单位点投射的且在REM睡眠期具有特定的活动特征，为进一步研究具有如此独特性的orexin神经元亚群的神经环路基础。同样采用orexin-Cre转基因小鼠，首先在其SLD区域进行立体定位注射，标记出投射至SLD的orexin神经元亚群。再采用逆行病毒追踪技术追踪该神经元亚群的上游全脑输入，通过初步研究发现与整体orexin神经元的全脑输入分布相比，这群特异性投射至SLD的orexin神经元可能更多地接受了ZI和DMH脑区的输入（n=2mice）。<br>　　综上所述，本研究发现下丘脑中有一部分orexin神经元是能够特异性投射至REM睡眠关键脑区SLD，可能接受来自其他脑区不同数量的输入，在REM睡眠期间激活下游投射靶区进而在睡眠/觉醒周期中发挥调控功能。此外，特异性抑制或损毁该orexin神经元亚群将会导致REM睡眠不稳定从而影响整体睡眠/觉醒稳态。故本研究揭示了下丘脑orexin神经元-脑干SLD通路调控REM睡眠的相关活动特点、功能意义及环路机制，为进一步明确相关orexin能神经系统整体协调和调控睡眠/觉醒整体稳态提供新的研究方向。