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摘要背景及目的：<br>　　慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性的公共卫生问题，肝细胞内的共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV难以彻底清除进而引起不同临床结局的根本原因，但因检测需依赖肝活检而难以临床普及；虽然外周血中无法直接检测cccDNA，但可通过其他血清指标来反映cccDNA的变化。目前，核苷（酸）类似物（NAs）是主要的抗HBV治疗手段，但并不能直接清除cccDNA，绝大部分的慢性HBV感染者均需长期用药。尽管高耐药屏障NAs使用后发生耐药的几率较前大为减少，但因HBV突变的必然性和复杂性，耐药株的出现实际上是NAs长期治疗不可避免的临床问题。不同于乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和HBVDNA，HBVRNA仅由cccDNA转录产生且不受NAs治疗的影响，可较为真实反映肝内cccDNA的表达情况。然而，HBVRNA检测尚无公认的标准化检测方法，其在慢性HBV感染者病情评估以及在NAs治疗耐药监测中的临床价值尚缺乏针对性研究。<br>　　我们首先使用微滴数字PCR（ddPCR）技术建立了定量检测血清HBVRNA的方法，并使用商业化的实时荧光定量PCR方法进行对比评估以确保检测结果的准确性。然后我们观察了未治的慢性HBV感染者不同临床表型的血清HBVRNA水平，并追踪分析了恩替卡韦初治但在随访过程中发生了基因型耐药(GR)和部分病毒学应答(PVR)患者血清HBVRNA的动力学特征以及耐药突变情况，以期为血清HBVRNA应用于慢性HBV感染者病情评估以及监测耐药突变提供新的依据。<br>　　方法：<br>　　1.获取治疗和未治疗的慢性HBV感染者的血清各32例，平行使用ddPCR和商品化的qPCR方法检测血清HBVRNA水平，使用直线回归分析和Bland-Altman分析两种方法的相关性和一致性；以1例高浓度的HBVRNA样本进行梯度稀释，两种检测方法平行进行测定，每个梯度重复5次以明确两种方法的重复性，敏感性。<br>　　2.根据常见临床指标将149例未治的慢性HBV感染者分为HBeAg阳性伴ALT正常（EPNA）、HBeAg阳性伴ALT升高（EPEA）、HBeAg阴性伴ALT正常（ENNA）、HBeAg阳性伴ALT升高（ENEA）等4种临床表型。使用qPCR法检测血清HBVRNA水平并在血清HBVDNA或/和HBVRNA阴性的患者中实施肝活检。使用单因素logistics回归分析探讨HBeAg阴性患者中与ALT升高相关的危险因素。<br>　　3.以31例HBeAg阴性、HBVDNA阳性、ALT正常或者轻度异常（＜2倍正常参考值上限，ULN）的未治慢性HBV感染者为研究对象，检测其血清HBVRNA水平，肝活检Scheuer评分系统对肝脏炎症评分（G）≥2判定为显著性肝炎，以受试者工作曲线（ROC）探讨血清HBVRNA水平在鉴别显著性肝炎中的价值。<br>　　4.在我院肝炎数据库中筛选出5例ETV初治的慢性乙型肝炎（CHB）患者，其中包含了在持续抗病毒治疗过程中被检出GR的患者3例以及未检出耐药的PVR患者2例。耐药突变的信息是采用一代测序针对血清HBVDNA检测得到。调取生物样本库中该患者从初治到随访终点之间的血清样本，以ddPCR方法检测血清HBVRNA水平，观察其与HBsAg、HBVDNA动态变化的特征，并使用三代测序技术（TGS）对部分随访点的血清HBVRNA的反转录区进行耐药突变的长期监测。<br>　　结果<br>　　1.两种血清HBVRNA检测方法在未治疗组和治疗组中的直线回归系数（R2）分别为0.912和0.874，95%一致性界限分别为（-1.430,1.506）和（-1.533,1.648）。梯度稀释实验显示ddPCR法和商品化的qPCR法在血清HBVRNA≥2.0log10copies/mL时检出率均为100%，CV值分别介于2.29%~10.8%和3.11%~7.33%；但在血清HBVRNA＜2.0log10copies/mL时，随着梯度稀释倍数的增加，检出率逐渐下降，最低检测下限（LLoD）分别约为61copies/mL和15copies/mL。ddPCR法和商品化的qPCR法在HBVRNA可测结果和稀释倍数之间存在显著性线性相关，R2分别为0.895和0.938，P＜0.0001。<br>　　2.EPNA、EPEA、ENNA和ENEA四种临床表型的可测血清HBVRNA水平（log10copies/mL）分别为6.02±1.48、6.54±1.27、2.51±0.78和3.54±1.25。HBVRNA低水平（＜2.0log10copies/mL）中以ENNA表型为主（76.9%），高水平（＞6.0log10copies/mL）中以HBeAg阳性表型（EPNA和EPEA）为主（98.1%）。在EPNA、EPEA和ENEA中，血清HBVRNA与血清HBVDNA显著正相关，相关系数（r）分别为0.868（P=9.480×10-9）、0.687（P=2.621×10-8）、0.769（P=6.686×10-9），但在ENNA表型中，两者没有显著性相关关系（r=0.324，P=0.075）。在EPNA、EPEA表型中，血清HBVRNA与HBsAg呈现显著正相关，相关系数分别为0.777（P=2.999×10-6）和0.637（P=4.993×10-7），但在HBeAg阴性表型中则无此显著相关性。血清HBVDNA和HBVRNA水平均是与HBeAg阴性患者ALT升高相关的独立危险因素，比值比（OR）分别为2.650(1.640~4.282)，P=6.823×10-5和2.570(1.541~4.286)，P=2.971×10-4。血清HBsAg水平则处于接近于显著性的状态（P=0.053）。7例血清HBVDNA阴性，但RNA阳性的患者肝组织活检均显示为中度或重度肝脏炎症（G≥2）。<br>　　3.血清HBVRNA水平具有鉴别HBeAg阴性、DNA阳性、ALT正常或者轻度异常（＜2×ULN）患者显著性肝炎的能力，受试者工作曲线下面积（AUC）为0.737（0.549，0.925），P=0.029，而HBVDNA则不具有这种能力（P=0.248）。根据最大优登指数得出HBVRNA用于鉴别肝脏显著性炎症的最佳截断值为2.81log10copies/mL，此时敏感度73.7%，特异度66.7%，准确度71.0%。<br>　　4.患者GR1、GR2和GR3分别在其抗病毒治疗第208、186及142周时检测出了耐药突变，在这时间点之前，3例患者血清HBVRNA持续＞4.0log10copies/mL。2例PVR患者在我们观测的抗病毒治疗期间HBVRNA持续＞6.0log10copies/mL。患者GR1和GR2在换用或者加用TDF之后，血清HBVRNA水平分别在此之后的26、22周时下降了1.63log10和2.58log10，HBVDNA水平则分别从4.40log10和3.44log10均降至LLoD，而HBsAg则几乎没有变化（分别上升0.03log10和下降0.02log10）。3例GR患者和2例PVR患者的血清HBVRNA的RT区耐药位点突变结果与HBVDNA的耐药位点检测结果是一致的。利用三代测序技术对HBVRNART区长期监测发现，患者GR1和GR3在耐药发生之前没有观测到常见耐药位点的突变，而GR2患者则从初治开始就具备rtL180M+M204I突变。<br>　　结论：<br>　　1.我们使用ddPCR建立的方法和qPCR方法均是可靠的血清HBVRNA定量检测方法，低浓度血清样本的检出是困难的，但可以增加重复检测次数来改善；<br>　　2.血清HBVRNA在不同临床表型中的水平存在差异，提示血清HBVRNA可以用于未治慢性HBV感染者病情的评估。血清HBVRNA与血清HBVDNA均是未治HBeAg阴性患者ALT升高的独立危险因素，因此在血清HBVDNA阴性患者中检测HBVRNA是必要的，血清HBVRNA可补充HBVDNA用于反映肝脏炎症；<br>　　3.在未经治疗的正常或者轻度ALT异常（ALT＜2×ULN）的HBeAg阴性患者中，血清HBVRNA可以用来判定肝脏炎症程度但HBVDNA不具备这样的能力，因此这部分患者可通过血清HBVRNA水平作为启动抗病毒治疗的依据；<br>　　4.血清HBVRNA水平以及利用HBVRNA测序分析适合用于长期监测慢性乙型肝炎患者NAs抗病毒疗效和基因耐药突变的发生。<br>　　总之，血清HBVRNA作为一个病毒学指标，可在血清HBVDNA阴性或者ALT＜2×ULN的未治HBeAg阴性患者中用于肝脏炎症的评估；血清HBVRNA也适合用于持续NAs治疗患者抗病毒疗效的评估以及耐药突变的长期监测，进而帮助临床医师为患者制定个体化管理和治疗策略提供参考依据。