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摘要背景:肺动脉高压(pulmonaryarterialhypenension,PAH)是一类临床中常见的心血管疾病,其定义是指在海平面静息状态下,经右心导管法所检测得到的肺动脉平均压力≥25mmHg.PAH的主要特征是肺血管阻力的增加和肺部血管结构的重塑.其中肺动脉平滑肌细胞(Pulmonaryarterysmoothmusclecells,PASMCs)的异常增殖和迁移在PAH中起到至关重要的作用.由于其病理生理机制的复杂性,PAH具有高发病率和高死亡率的特点,严重时会导致右心衰竭而亡.目前对于PAH的药物治疗效果有限,且只能改善患者临床症状,并不能延缓PAH的发展进程.因此对于PAH的治疗仍需开发针对PASMCs异常增殖及迁移的药物.<br>　　PDE10抑制剂可通过抑制磷酸二酯酶10(PDE10)的活性,使体内cGMP的水平升高,从而激活PKG,进一步抑制Rho/ROCK信号通路的激活从而逆转肺血管收缩与肺动脉平滑肌细胞的增殖.本课题中PDE10抑制剂(PDE10i)是由中山大学药学院教授罗海彬所设计合成.通过前期实验观察到,PDE10i对PAH大鼠的治疗具有显著改善作用,且对PASMCs有较好的抗增殖和抗迁移的作用.因此,PDE10i有望成为治疗PAH的候选药物之一.<br>　　目的:本研究采用一次性腹腔注射野百合碱(MCT,55mg/kg)建立大鼠肺动脉高压模型,给予PDE10i药物干预治疗21天.通过PowerLab数据采集分析系统、测定右心肥厚指数、病理组织学、平滑肌肌动蛋白免疫组织化学以及酶联免疫吸附法(ELISA)等方法,评估PDE10i对于PAH大鼠的药效作用.采用酶消化法原代提取大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),应用血小板源性生长因子(PDGF-BB,20ng/mL)诱导其增殖和迁移.通过划痕实验探究PDE10i对PASMCs迁移的影响.基于蛋白质印迹法(WesternBlot)考察PDE10i干预后Rho/ROCK信号通路相关蛋白表达情况,探究PDE10i治疗PAH的作用机制.<br>　　方法:本课题分为三大部分:<br>　　(1)将75只SD大鼠随机分成5组,每组15只动物.各组分别为正常组(生理盐水i.p.)、MCT组(生理盐水i.p.)、PDE10i低剂量组(1mg/kg/di.p.)、PDE10i高剂量组(3mg/kg/di.p.)、西地那非(Sildenafil)组(20mg/kg/di.p.).除正常组外,其余各组大鼠每只一次性腹腔注射2%MCT溶液(55mg/kg).造模结束后给予相应药物21天.<br>　　(2)给药治疗第21天时采用右心导管法检测每只大鼠右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP),并计算右心室肥厚指数(RVHI).通过HE染色、Masson染色以及平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组化等组织病理学方法观察PAH发生时肺血管重塑、心肌细胞受损及PASMCs增殖情况.利用ELISA法检测大鼠血清中cGMP和cAMP的含量变化,进一步评估PDE10i对MCT所致肺动脉高压大鼠的药效作用.<br>　　(3)采用0.2%I型胶原酶消化法原代提取大鼠PASMCs,免疫荧光鉴定后将其作为PDE10i作用机制的研究对象,应用PDGF-BB(20ng/mL)诱导PASMCs增殖并迁移,设置Control组、PDGF-BB组、PDGF-BB+PDE10i(6μmol/L)组.通过划痕实验检测PDE10i对PASMCs迁移能力的影响.基于WB检测各组细胞内PKG、RhoA、RhoB、ROCK1、ROCK2、MYPT1及其磷酸化蛋白、Bax、Bcl-2和p27kip1蛋白的表达情况,以此探讨PDE10i在PAH中可能介导的信号通路.<br>　　结果:(1)与正常组的大鼠相比,其余各组大鼠的RVSP、mPAP均显著高于正常组(plt;0.001),说明模型建造成功.经PDE10i给药干预后,均能显著降低(plt;0.01)由MCT所致的大鼠RVSP、mPAP的升高,并呈现一定的剂量依赖性.从右心肥厚指数RVHI结果来看,模型组大鼠的RVHI显著高于正常组(plt;0.001).经过PDE10i的治疗后,大鼠的右心肥厚指数值均有不同程度的改善作用(plt;0.01).<br>　　(2)HE染色、Masson染色、α-SMA免疫组化等结果显示,MCT组的大鼠肺动脉中PASMCs大量异常增生(plt;0.001),肺动脉壁明显增厚且管腔变窄,肺血管结构重塑,大鼠的心肌细胞由于PAH而出现细胞间质肿大,心肌纤维断裂,大量炎性细胞浸润的情况.经PDE10i治疗后,高剂量组大鼠肺动脉壁增厚程度显著下降(plt;0.001)且管腔扩大,PDE10i高剂量组可改善大鼠心肌细胞的损伤程度.PDE10i高剂量组可抑制PASMCs的增殖从而显著降低α-SMA的表达(plt;0.01).ELISA法检测PAH大鼠血清中第二信使的含量,与正常组相比,PDE10i可显著升高cAMP和cGMP的含量(plt;0.05).<br>　　(3)划痕结果显示,PDE10i可抑制PASMCs的增殖和迁移能力.WB实验结果表明,与Control组相比,PDGF-BB组PKG表达显著降低,PDE10i(6μmol/L)组能显著升高细胞内PKG蛋白表达水平,且具有统计学差异(plt;0.001);与Control组相比,PDGF-BB组RhoA、RhoB、ROCK1、ROCK2、MYPT-1蛋白磷酸化水平表达显著升高,而经PDE10i药物干预后,可显著下调及抑制蛋白的磷酸化.检测p27kip-1蛋白结果显示,PDE10i给药后可显著上调p27kip-1蛋白的表达.此外,PDGF-BB组可显著增加下游因子中Bcl-2/Bax比值(plt;0.01),经PDE10i治疗后,可显著降低Bcl-2/Bax比值,且存在统计学差异(plt;0.05).<br>　　结论:(1)PDE10i可有效降低由MCT所致肺动脉高压大鼠的血流动力学异常,改善PAH发生时肺血管重塑的情况.<br>　　(2)PDE10i可通过提高PKG蛋白表达,抑制Rho-ROCK信号通路的激活进而抑制PASMCs的异常增殖和迁移,从而来改善和治疗PAH.