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摘要【目的】<br>　　研究淀粉样蛋白结合醇脱氢酶ABAD与线粒体功能和认知障碍之间的关系，获得干扰ABAD可损害小鼠认知功能的可靠证据，阐明在ABAD干扰下，线粒体融合/分裂所发生的变化，确定ABAD与线粒体动力蛋白DRP1、线粒体分裂因子MFF存在相互作用，并证实ABAD干预线粒体自噬过程；探究在干扰ABAD条件下，线粒体功能和形态的变化，阐明干扰ABAD可通过干预线粒体动力学、线粒体自噬途径影响线粒体功能，引起认知障碍的新机制。<br>　　【方法】<br>　　1、小鼠模型及细胞模型的建立：脑立体定位10月龄C57小鼠的海马（前囟-2.5mm，旁开±1.8mm，深-2.2mm），两侧注射ABAD干扰腺相关病毒1ul，缝合后继续饲养1个月待病毒完全表达，建立动物模型实验组；同等条件下及注射位点注射相应对照腺相关病毒，作为对照，部分小鼠心室生理盐水灌注，留取海马，部分小鼠制成冰冻切片及电镜样本。用高糖培养基培养SH-SY5Y细胞，置于37℃、5%CO2气体的细胞培养箱培养，待其密度长至60%-70%时，转染si-ABADRNA48h，作为实验组；同等条件下，对应NC-RNA转染SH-SY5Y48h作为对照组，分别收集细胞。Western-blot鉴定ABAD在SH-SY5Y和C57小鼠海马中的表达量。<br>　　2、行为学检测认知功能：脑立体定位C57小鼠海马，注射干扰ABAD腺相关病毒，待1月后病毒表达，进行新物体识别和水迷宫检测，观察干扰ABAD后对小鼠认知功能的影响；同时进一步检测糖水实验、悬尾实验、强迫游泳等抑郁相关行为学实验，以排除脑定位注射引起抑郁相关认知障碍。<br>　　3、线粒体动力学检测：Western-blot分别检测脑立体定位小鼠海马组织线粒体融合相关蛋白OPA1/MFN2、线粒体分裂相关蛋白DRP1/MFF蛋白表达水平，了解干扰ABAD与线粒体动力学之间的关系；免疫荧光进一步证实。<br>　　4、线粒体自噬相关检测：Western-blot分别检测脑立体定位小鼠海马组织及SH-SY5Y细胞线粒体自噬相关蛋白LC3和P62蛋白表达量，探究干扰ABAD对线粒体自噬过程的影响；戊二醇全身灌注，快速获取小鼠海马组织，固定、包埋、切片，电镜观察小鼠海马组织自噬相关结构的变化，了解干扰ABAD与线粒体自噬的关系。<br>　　5、线粒体功能检测：收集转染后的细胞，使用JC-1检测试剂盒、活性氧检测试剂盒在流式检测仪帮助下检测线粒体膜电位和活性氧的变化；使用ATP增强型检测试剂盒在荧光素酶检测仪帮助下检测线粒体三磷酸腺苷的生成量，探究干扰ABAD对线粒体功能的影响；使用Mito-TrackerGreen免疫荧光观察线粒体的形态和数量。<br>　　【结果】<br>　　1、10月龄C57小鼠脑立体定位海马，注射干扰ABAD腺相关病毒，待1月后病毒表达完全后进行行为学检测。水迷宫提示干扰ABAD可导致小鼠学习能力下降；新物体识别提示干扰ABAD可影响小鼠的空间记忆能力。同时，悬尾实验、糖水实验、强迫游泳实验排除了抑郁相关认知障碍。<br>　　2、动物水平上，免疫印迹法检测C57小鼠海马组织在干扰ABAD后线粒体动力学相关蛋白表达水平。有趣的是，线粒体分裂相关蛋白DPR1及MFF显著下降，而线粒体融合相关蛋白OPA1及MFN2无明显改变，这一结果表明线粒体分裂、融合比例失调，干扰ABAD直接导致线粒体分裂减少；同样，线粒体分裂蛋白减少也在C57小鼠海马组织的免疫荧光检测中得到验证；免疫印迹法检测干扰ABAD对C57小鼠海马组织线粒体自噬相关蛋白表达水平的影响。值得注意的是，LC3蛋白水平不变，但溶酶体标记蛋白P62显著下降；透射电镜对制备的海马组织进行观察，与AVV-Vertor组相比，干扰ABAD后海马神经元中溶酶体显著减少，这一结果表明干扰ABAD可能是通过影响溶酶体数量干扰线粒体自噬过程。<br>　　3、细胞水平上，免疫印迹法检测SH-SY5Y细胞在干扰ABAD后线粒体自噬相关蛋白表达水平。结果同动物水平实验一致，溶酶体标记蛋白P62显著下降，而LC3蛋白水平不变。流式结果提示，干扰ABAD后SH-SY5Y细胞线粒体功能受损，即线粒体膜电位下降、活性氧生成增多。同时，荧光素酶检测结果提示，amp;nbsp;ATP生成减少。此外，Mito-TrackerGreen免疫荧光发现，SH-SY5Y细胞在干扰ABAD后线粒体数量增多，但体积变小，呈现碎片化改变。<br>　　【结论】<br>　　1、干扰C57小鼠海马ABAD表达导致小鼠学习能力及空间识别能力受损。<br>　　2、干扰ABAD的海马组织出现线粒体动力学失衡。<br>　　3、干扰ABAD的海马组织中线粒体自噬过程滞怠，可能是溶酶体数量减少所致。<br>　　4、SH-SY5Y细胞中干扰ABAD会导致线粒体功能障碍。<br>　　5、ABAD干扰后引起SH-SY5Y细胞的线粒体自噬过程滞怠，且溶酶体数量减少。