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摘要【目的】<br>　　1.建立梅毒螺旋体感染巨噬细胞模型。<br>　　2.分离和鉴定梅毒螺旋体诱导巨噬细胞产生的外泌体并观察巨噬细胞对外泌体的内化作用。<br>　　3.探讨梅毒螺旋体诱导巨噬细胞产生的外泌体对巨噬细胞极化的作用。<br>　　【方法】<br>　　1.巨噬细胞感染模型：在THP-1细胞中加入浓度为100ng/mlPMA，诱导48h产生巨噬细胞；自雄兔睾丸分离梅毒螺旋体（Tp），将30个感染复数的梅毒螺旋体加入巨噬细胞中，用不含双抗RMPI-1640培养基培养24h。<br>　　2.外泌体的分离和纯化：更换去外泌体培养基，继续培养48h，收集细胞上清液进行梯度离心，先按照条件300xg，10min；2000xg，20min；10000xg，30min离心，去除细胞碎片，最后按条件135000xg，70min超高速离心对外泌体（Exo-Tp）进行分离，同时以未加入梅毒螺旋体感染组为阴性对照组，提取外泌体（Exo），-80℃储存。<br>　　3.外泌体的鉴定：通过Westernblot（WB）、透射电镜、纳米颗粒跟踪分析（NTA）对外泌体蛋白、形态、直径进行测定。<br>　　4.外泌体内化实验：用亲脂染色剂PKH67对外泌体进行染色，以20μg/mL的浓度与巨噬细胞共培养4h，用CD68抗体标记巨噬细胞表面抗原，在激光共聚焦显微镜下观察细胞对外泌体的内化作用。<br>　　5.验证外泌体对巨噬细胞的极化作用：将分离的Exo-Tp以20μg/mL的浓度加入M0型巨噬细胞中，共培养24h，同时以加入Exo组作为阴性对照组，不加入外泌体组为空白对照组，以6h、12h、24h为时间点，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测iNOS、IL-12、Arg-1、IL-10等mRNA的表达，通过流式细胞术对巨噬细胞表型MHC-II、CD86、CD206、CD209进行鉴定。<br>　　6.统计学方法：本实验采用SPSS22.0软件进行方差分析进行统计。<br>　　【结果】<br>　　1.外泌体的鉴定<br>　　WB结果发现Exo及Exo-Tp组CD9、ALIX、HSP70、TSG-101、Annexin-V条带均可显示；透射电镜视野下可见多量直径50-160nm不等的盘状囊泡；NTA结果显示样本Exo组外泌体颗粒浓度为5.6×109个/mL,粒径峰值119.6nm，峰面积占比91.7%，实测平均粒径大小142.0nm；Exo-Tp组外泌体颗粒浓度为7.1×109个/mL，粒径峰值117.3nm，峰面积占比95.0%，实测平均粒径大小141.3nm,两组外泌体基本处于30-200nm的分布范围。<br>　　2.外泌体内化实验：激光显微共聚焦显微镜下可见Exo组和Exo-Tp组巨噬细胞顺利对外泌体完成内吞，外泌体多分布在细胞质部分，细胞核区域无分布。<br>　　3.验证巨噬细胞极化：qRT-PCR结果显示Exo-Tp组iNOS、IL-12mRNA表达量均明显上调（Plt;0.05），且随共培养时间的延长而上调，表达得更显著，而Arg-1、IL-10表达无明显统计学意义；而Exo组iNOS、IL-12、Arg-1、IL-10mRNA表达均无明显变化。流式细胞术结果显示Exo-Tp组MHC-II阳性（Plt;0.05），而CD86、CD206、CD209变化无统计学意义；Exo组MHC-II、CD86、CD206、CD209变化皆无统计学意义。<br>　　【结论】<br>　　1.M0巨噬细胞能正常内化外泌体。<br>　　2.M0巨噬细胞内化Exo-Tp后，引起iNOS、IL-12mRNA表达上调，表达MHC-II表面标志物的细胞百分比增加，而不表达CD86、CD206、CD209。<br>　　3.Exo-Tp能诱导M0巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，不能向M2型产生极化效果。