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摘要肾癌是一种全球性疾病，具有高发病率和死亡率，仅在2018年，全球癌症观察站（Global Cancer Observatory）就记录了约40万例新发和17.5万例死亡病例，其中90%以上是肾细胞癌（Renal cell carcinoma,RCC）。目前RCC的分类主要是基于组织学分析，分为肾透明细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）和非透明肾细胞癌（nccRCC），其中ccRCC是最常见的类型，约占所有RCC的75-80%，不过其对化学和放射治疗均不敏感。因此，进一步明确ccRCC发病的分子机制，发现新的生物标志物及可靠的诊断和治疗靶点就显得非常重要。<br>　　长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）缺乏开发阅读框，不编码蛋白质，是一种长度大于200nt碱基的RNA。越来越多的证据表明，lncRNA调节大量基因的异常表达，在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色，且在肿瘤的诊断和治疗方面是非常有潜能的分子标志物。LncRNA AGAP2-AS1（AGAP2Antisense RNA1）在多种实体肿瘤组织中高表达，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌和食管癌等，但对肾癌发病过程的影响及具体机制研究仍然未知。<br>　　本研究主要探讨lncRNA AGAP2-AS1在肾癌疾病进展过程中的作用及机制，首先分析了TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中AGAP2-AS1的表达情况和临床相关病理特征的联系，并检测了肾癌细胞系中AGAP2-AS1的表达情况，提示AGAP2-AS1在肾癌的诊疗中可能具有相当大的价值。此外，通过体外功能实验，探索AGAP2-AS1对肾癌增殖、侵袭和迁移的影响，同时通过体内动物实验验证，并进一步研究潜在的分子作用机制。总体来讲本研究由以下三部分组成：<br>　　第一部分 长链非编码RNA AGAP2-AS1在人肾透明细胞癌中的表达及临床意义<br>　　目的：探讨AGAP2-AS1在肾透明细胞癌中的表达情况，分析其与年龄、性别、肿瘤体积大小（T）、淋巴结转移（N）、远处转移（M）和预后的关系，并检测人肾癌细胞系及人近端肾小管上皮细胞（HKC8）中AGAP2-AS1的表达。<br>　　方法：检索并分析TCGA数据库AGAP2-AS1在正常肾脏组织（或）癌旁组织及肾透明细胞癌组织中的表达;利用统计学方法分析AGAP2-AS1表达与临床相关指标间的关系。最后利用荧光定量PCR（RT-PCR）检测在人肾癌细胞株及正常近端肾小管上皮细胞中AGAP2-AS1的表达情况。<br>　　结果：与正常组织相比，AGAP2-AS1在肾透明细胞癌及肾癌细胞系的表达均显著上调，其异常表达与肾透明细胞癌的分级（Grade）、病理TNM分期都有密切联系，与不良的总生存期显著相关，是影响肾透明细胞癌总体生存率的独立预后因子。而且AGAP2-AS1对于识别正常与不同阶段的肾透明细胞癌组织具有很好的区分能力（AUC均大于0.8）。<br>　　结论：长链非编码RNA AGAP2-AS1在肾透明细胞癌组织和肾癌细胞株中异常高表达，其异常表达与肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移等密切相关，预示着不良的临床预后。<br>　　第二部分 长链非编码RNA AGAP2-AS1对肾透明细胞癌增殖、侵袭及迁移的影响<br>　　目的：通过构建过表达及敲低AGAP2-AS1肾癌细胞系，探讨AGAP2-AS1的不同表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响<br>　　方法：构建AGAP2-AS1过表达及敲低质粒，通过氯化钙转染的方法利用293T细胞收获慢病毒，并将收获的慢病毒转染到769-P和SW839细胞中，建立稳定高表达和低表达AGAP2-AS1的肾癌细胞系。RT-PCR鉴定稳定转染细胞系中AGAP2-AS1的表达水平。利用MTT方法、细胞克隆形成实验观察AGAP2-AS1改变对肾癌细胞增殖水平的影响；采用划痕实验（wound healing），transwell侵袭实验检测AGAP2-AS1对肾癌细胞侵袭功能的影响。在裸鼠右侧上肢皮下种植约1ⅹ107个肾癌细胞，分为对照组和稳定转染敲低AGAP2-AS1实验组，检测敲低AGAP2-AS1表达的对肾细胞癌细胞的成瘤效果和增殖生长速度的影响。<br>　　结果：1.肾癌细胞769-P中AGAP2-AS1含量较低，而肾癌细胞SW839内AGAP2-AS1含量较高；因此在肾癌细胞769-P内过表达AGAP2-AS1，在SW839细胞中敲低AGAP2-AS1；RT-PCR结果显示，稳定转染过表达AGAP2-AS1和敲低AGAP2-AS1的肾癌细胞系构建成功。2.敲低AGAP2-AS1显著抑制肾细胞癌细胞的增殖、侵袭及转移。3.过表达AGAP2-AS1显著促进肾细胞癌细胞的增殖、侵袭及转移。4.动物体内实验证明，敲低AGAP2-AS1显著肾癌移植瘤的生长速度。<br>　　结论：过表达AGAP2-AS1显著促进肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力；敲低AGAP2-AS1抑制肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力；敲低AGAP2-AS1抑制肾癌细胞在裸鼠体内的成瘤及生长速度。<br>　　第三部分 AGAP2-AS1竞争性抑制miR-185-5p结合AGAP2靶向调控AKT通路的机制研究<br>　　目的：探讨AGAP2-AS1调节miR-185-5p靶向AGAP2，影响AKT通路活性的具体机制，明确AGAP2-AS1与miR-185-5p、miR-185-5p与AGAP2、AGAP2与AKT通路的调控关系。<br>　　方法：1.过表达AGAP2-AS1及其所具有的两个外显子，检测AGAP2蛋白的表达变化。2.利用Targetscans数据库，寻找能与AGAP23’UTR区域（AGAP2-AS1和AGAP23’UTR重叠的部分）结合的miRNAs。构建生物素探针标记的AGAP2探针及含有miR-185-5p结合位点的AGAP2荧光素酶报告载体，并设计合成miR-185-5p的模拟物（mimics）及对照，miR-185-5p的抑制剂（inhibitor）及其对照。3.应用RNA pulldown实验证明AGAP2-AS1与AGAP2的结合，双荧光素酶实验和Western Blog检测miR-185-5p与AGAP2的结合。设计“功能回复”实验，进一步验证AGAP2-AS1是否竞争抑制miR-185-5p与AGAP2结合。4.过表达和敲低AGAP2，检测p-Akt和Akt的蛋白表达。<br>　　结果：1.过表达AGAP2-AS1上调AGAP2的蛋白表达，敲低AGAP2-AS1下调AGAP2的蛋白表达，且过表达AGAP2-AS1的外显子1显著上调AGAP2的表达。2.RNA pulldown实验结果表明，AGAP2-AS1可以结合AGAP2。3.Targetscan数据库分析预测结果显示，miR-136-5p、miR-185-5p和miR-379-5p可以与AGAP2的3’UTR结合。双荧光素酶实验及Western Blot实验结果表明，miR-185-5p与AGAP2结合。4.“功能回复”实验结果表明，加入miR-185-5p抑制剂可以挽救敲低AGAP2-AS1所引起的下游AGAP2的蛋白表达。反之，加入miR-185-5p的模拟物可以部分回复上调AGAP2-AS1引起的AGAP2蛋白的表达。5.加入过表达AGAP2质粒可以挽救敲低AGAP2-AS1所引起的下游AGAP2、p-AKT的蛋白表达。反之，加入敲低AGAP2可以部分上调AGAP2-AS1引起的下游AGAP2、p-AKT的蛋白表达。6.加入miR-185-5p抑制剂、过表达AGAP2质粒可以部分挽回沉默AGAP2-AS1对肾癌细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用。<br>　　结论：1.AGAP2-AS1主要通过其长度较短的外显子影响下游AGAP2的表达变化。2.AGAP2-AS1可以结合AGAP2。3.AGAP2-AS1竞争性抑制miR-185-5p与AGAP2的3’UTR结合。4.AGAP2-AS1调节AGAP2的表达变化，影响Akt信号通路，从而影响肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移。