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长链非编码RNA AGAP2-AS1竞争性抑制miR-185-5p调节AGAP2影响肾癌发展的机制研究

摘要肾癌是一种全球性疾病,具有高发病率和死亡率,仅在2018年,全球癌症观察站(Global Cancer Observatory)就记录了约40万例新发和17.5万例死亡病例,其中90%以上是肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)。目前RCC的分类主要是基于组织学分析,分为肾透明细胞癌(Clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)和非透明肾细胞癌(nccRCC),其中ccRCC是最常见的类型,约占所有RCC的75-80%,不过其对化学和放射治疗均不敏感。因此,进一步明确ccRCC发病的分子机制,发现新的生物标志物及可靠的诊断和治疗靶点就显得非常重要。<br>  长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)缺乏开发阅读框,不编码蛋白质,是一种长度大于200nt碱基的RNA。越来越多的证据表明,lncRNA调节大量基因的异常表达,在肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色,且在肿瘤的诊断和治疗方面是非常有潜能的分子标志物。LncRNA AGAP2-AS1(AGAP2Antisense RNA1)在多种实体肿瘤组织中高表达,如乳腺癌、结直肠癌、肺癌和食管癌等,但对肾癌发病过程的影响及具体机制研究仍然未知。<br>  本研究主要探讨lncRNA AGAP2-AS1在肾癌疾病进展过程中的作用及机制,首先分析了TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中AGAP2-AS1的表达情况和临床相关病理特征的联系,并检测了肾癌细胞系中AGAP2-AS1的表达情况,提示AGAP2-AS1在肾癌的诊疗中可能具有相当大的价值。此外,通过体外功能实验,探索AGAP2-AS1对肾癌增殖、侵袭和迁移的影响,同时通过体内动物实验验证,并进一步研究潜在的分子作用机制。总体来讲本研究由以下三部分组成:<br>  第一部分 长链非编码RNA AGAP2-AS1在人肾透明细胞癌中的表达及临床意义<br>  目的:探讨AGAP2-AS1在肾透明细胞癌中的表达情况,分析其与年龄、性别、肿瘤体积大小(T)、淋巴结转移(N)、远处转移(M)和预后的关系,并检测人肾癌细胞系及人近端肾小管上皮细胞(HKC8)中AGAP2-AS1的表达。<br>  方法:检索并分析TCGA数据库AGAP2-AS1在正常肾脏组织(或)癌旁组织及肾透明细胞癌组织中的表达;利用统计学方法分析AGAP2-AS1表达与临床相关指标间的关系。最后利用荧光定量PCR(RT-PCR)检测在人肾癌细胞株及正常近端肾小管上皮细胞中AGAP2-AS1的表达情况。<br>  结果:与正常组织相比,AGAP2-AS1在肾透明细胞癌及肾癌细胞系的表达均显著上调,其异常表达与肾透明细胞癌的分级(Grade)、病理TNM分期都有密切联系,与不良的总生存期显著相关,是影响肾透明细胞癌总体生存率的独立预后因子。而且AGAP2-AS1对于识别正常与不同阶段的肾透明细胞癌组织具有很好的区分能力(AUC均大于0.8)。<br>  结论:长链非编码RNA AGAP2-AS1在肾透明细胞癌组织和肾癌细胞株中异常高表达,其异常表达与肿瘤大小、淋巴结转移和远处转移等密切相关,预示着不良的临床预后。<br>  第二部分 长链非编码RNA AGAP2-AS1对肾透明细胞癌增殖、侵袭及迁移的影响<br>  目的:通过构建过表达及敲低AGAP2-AS1肾癌细胞系,探讨AGAP2-AS1的不同表达水平对肾癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响<br>  方法:构建AGAP2-AS1过表达及敲低质粒,通过氯化钙转染的方法利用293T细胞收获慢病毒,并将收获的慢病毒转染到769-P和SW839细胞中,建立稳定高表达和低表达AGAP2-AS1的肾癌细胞系。RT-PCR鉴定稳定转染细胞系中AGAP2-AS1的表达水平。利用MTT方法、细胞克隆形成实验观察AGAP2-AS1改变对肾癌细胞增殖水平的影响;采用划痕实验(wound healing),transwell侵袭实验检测AGAP2-AS1对肾癌细胞侵袭功能的影响。在裸鼠右侧上肢皮下种植约1ⅹ107个肾癌细胞,分为对照组和稳定转染敲低AGAP2-AS1实验组,检测敲低AGAP2-AS1表达的对肾细胞癌细胞的成瘤效果和增殖生长速度的影响。<br>  结果:1.肾癌细胞769-P中AGAP2-AS1含量较低,而肾癌细胞SW839内AGAP2-AS1含量较高;因此在肾癌细胞769-P内过表达AGAP2-AS1,在SW839细胞中敲低AGAP2-AS1;RT-PCR结果显示,稳定转染过表达AGAP2-AS1和敲低AGAP2-AS1的肾癌细胞系构建成功。2.敲低AGAP2-AS1显著抑制肾细胞癌细胞的增殖、侵袭及转移。3.过表达AGAP2-AS1显著促进肾细胞癌细胞的增殖、侵袭及转移。4.动物体内实验证明,敲低AGAP2-AS1显著肾癌移植瘤的生长速度。<br>  结论:过表达AGAP2-AS1显著促进肾癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力;敲低AGAP2-AS1抑制肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力;敲低AGAP2-AS1抑制肾癌细胞在裸鼠体内的成瘤及生长速度。<br>  第三部分 AGAP2-AS1竞争性抑制miR-185-5p结合AGAP2靶向调控AKT通路的机制研究<br>  目的:探讨AGAP2-AS1调节miR-185-5p靶向AGAP2,影响AKT通路活性的具体机制,明确AGAP2-AS1与miR-185-5p、miR-185-5p与AGAP2、AGAP2与AKT通路的调控关系。<br>  方法:1.过表达AGAP2-AS1及其所具有的两个外显子,检测AGAP2蛋白的表达变化。2.利用Targetscans数据库,寻找能与AGAP23’UTR区域(AGAP2-AS1和AGAP23’UTR重叠的部分)结合的miRNAs。构建生物素探针标记的AGAP2探针及含有miR-185-5p结合位点的AGAP2荧光素酶报告载体,并设计合成miR-185-5p的模拟物(mimics)及对照,miR-185-5p的抑制剂(inhibitor)及其对照。3.应用RNA pulldown实验证明AGAP2-AS1与AGAP2的结合,双荧光素酶实验和Western Blog检测miR-185-5p与AGAP2的结合。设计“功能回复”实验,进一步验证AGAP2-AS1是否竞争抑制miR-185-5p与AGAP2结合。4.过表达和敲低AGAP2,检测p-Akt和Akt的蛋白表达。<br>  结果:1.过表达AGAP2-AS1上调AGAP2的蛋白表达,敲低AGAP2-AS1下调AGAP2的蛋白表达,且过表达AGAP2-AS1的外显子1显著上调AGAP2的表达。2.RNA pulldown实验结果表明,AGAP2-AS1可以结合AGAP2。3.Targetscan数据库分析预测结果显示,miR-136-5p、miR-185-5p和miR-379-5p可以与AGAP2的3’UTR结合。双荧光素酶实验及Western Blot实验结果表明,miR-185-5p与AGAP2结合。4.“功能回复”实验结果表明,加入miR-185-5p抑制剂可以挽救敲低AGAP2-AS1所引起的下游AGAP2的蛋白表达。反之,加入miR-185-5p的模拟物可以部分回复上调AGAP2-AS1引起的AGAP2蛋白的表达。5.加入过表达AGAP2质粒可以挽救敲低AGAP2-AS1所引起的下游AGAP2、p-AKT的蛋白表达。反之,加入敲低AGAP2可以部分上调AGAP2-AS1引起的下游AGAP2、p-AKT的蛋白表达。6.加入miR-185-5p抑制剂、过表达AGAP2质粒可以部分挽回沉默AGAP2-AS1对肾癌细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用。<br>  结论:1.AGAP2-AS1主要通过其长度较短的外显子影响下游AGAP2的表达变化。2.AGAP2-AS1可以结合AGAP2。3.AGAP2-AS1竞争性抑制miR-185-5p与AGAP2的3’UTR结合。4.AGAP2-AS1调节AGAP2的表达变化,影响Akt信号通路,从而影响肾癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

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