摘要目的:<br> 慢性炎症反应在肿瘤发生发展中发挥重要作用,其构成的炎症微环境主要由癌症相关成纤维细胞、细胞外基质、以及浸润性免疫细胞例如树突细胞(DC),髓系来源抑制细胞(MDSC),巨噬细胞和调节性T细胞(Treg)等组成。研究报道乳腺、胃肠道、头颈部等恶性肿瘤组织中大量Treg浸润与肿瘤进展密切相关;也有研究发现在非小细胞肺癌中,CD4+CD25+foxp3+Treg浸润增加可抑制效应T细胞的抗肿瘤作用。所以,肿瘤微环境Treg主要发挥免疫抑制作用可以促进肿瘤细胞发生发展。<br> 发现黄曲霉毒素G1(AFG1)诱导TNF-α介导肺组织炎症反应与肺腺癌(LA)发生密切相关,其中肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)发挥免疫细胞功能表达主要组织相容性复合体Ⅱ类(MHC-Ⅱ),可能与小鼠肺组织Treg浸润增强有关。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)被认为是肿瘤微环境的重要调节因子,体外细胞实验发现TNF-α可上调AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ的表达。一些文献报道肺泡上皮细胞表达MHC-Ⅱ分子,但是缺乏共刺激分子,发挥非特异抗原提呈细胞功能。那么在炎症诱导肺腺癌发生中,TNF-α介导的炎症反应是否诱导AT-Ⅱ细胞通过MHC-Ⅱ发挥免疫抑制作用,进而诱导Treg扩增尚不清楚。<br> 使用本研究团队前期应用的乌拉坦诱导TNF-α依赖的炎症介导小鼠肺腺癌发生模型(Inflammation-driven lung adenocarcinoma,IDLA),从整体水平上探讨TNF-α依赖性慢性炎症反应上调肺腺癌组织中AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ对Treg扩增的影响,进一步揭示肺组织炎症微环境中诱导Treg细胞增殖和分化机制,为炎症介导肺腺癌发生肿瘤病因机制提供新的理论依据。<br> 方法:<br> 1.Balb/c小鼠腹腔注射乌拉坦1次/周,连续8周后停止注射,构建肺组织炎症组,其余小鼠再继续饲养四个月后构建肺腺癌组;对照组小鼠给予腹腔注射PBS溶液1次/周。分别提取炎症组及肺腺癌组小鼠肺组织标本,采用免疫荧光法观察MHC-Ⅱ在AT-Ⅱ细胞上的表达情况;PCR检测AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ的表达情况;流式细胞学方法(FCM)检测AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ,CD80,CD86表达以及Treg浸润情况。<br> 2.肺腺癌组小鼠腹腔注射乌拉坦1次/周,PBS溶液2次/周;阻断剂组小鼠腹腔注射乌拉坦1次/周,TNF-α中和抗体sTNFR:Fc2次/周;对照组小鼠给予腹腔注射PBS溶液3次/周,连续8周后停止注射,再继续饲养四个月后处死。采用免疫荧光法、PCR分别检测AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ的表达情况;采用FCM检测AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达以及Treg浸润情况,观察抑制TNF-α依赖炎症反应对AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达以及肺组织Treg浸润的影响。<br> 3.体外分离提取对照组以及肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞与分选脾组织CD4+T细胞共培养,部分AT-Ⅱ细胞给予MHC-Ⅱ中和抗体预处理,FCM分别检测CD4+CD25+T细胞增殖以及Foxp3表达,进一步探讨IDLA中AT-Ⅱ细胞是否依赖MHC-Ⅱ导致Treg扩增。<br> 结果:<br> 1.炎症介导肺腺癌发生中AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达及Treg浸润<br> 小鼠肺腺癌组织标本以及分离肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞进行免疫荧光染色,发现肺腺癌细胞主要来源于AT-Ⅱ细胞,且MHC-Ⅱ在AT-Ⅱ来源的肿瘤细胞及癌旁AT-Ⅱ上皮细胞中表达均明显增加。这证明炎症诱导肺腺癌组织中AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ。采用FCM分析对照组以及肺腺癌组AT-Ⅱ细胞表型,发现与对照组相比,肺腺癌组AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达上调,但CD80和CD86并没有明显变化。这表明AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ可能发挥免疫抑制功能。从小鼠肺组织炎症期到肿瘤期,AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ在mRNA水平表达逐渐增加,FCM结果显示肿瘤期CD4+CD25+Treg浸润也高于炎症期,这表明小鼠肺腺癌组织中AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ可能与Treg扩增密切相关。<br> 2.TNF-α依赖性炎症反应调控炎症组肺组织AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达及Treg扩增<br> 给予TNF-α阻断剂sTNFR:Fc抑制乌拉坦依赖的炎症反应,炎症组肺组织中AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达下降,证实TNF-α依赖的肺组织炎症反应上调AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达。FCM检测发现给予TNF-α阻断剂肺组织CD4+CD25+Treg细胞数量明显少于炎症组,证实TNF-α依赖炎症反应调控肿瘤前期炎症组肺组织Treg的扩增。<br> 3.TNF-α依赖性炎症反应调控肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达及Treg扩增<br> RT-PCR和FCM结果显示注射sTNFR:Fc抑制IDLA组织中AT-Ⅱ细胞表达MHC-Ⅱ,以及肺腺癌组织中CD4+CD25+Treg扩增。证明TNF-?依赖炎症反应上调肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达可能与Treg扩增相关。<br> 4.肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞通过MHC-Ⅱ诱导Treg扩增<br> 分离肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞与MACS分选的脾脏CD4+T细胞共培养72小时后,CD4+CD25+细胞比例较对照组明显增多,且Foxp3的表达明显上调。这说明肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞诱导了CD4+CD25+Foxp3+Treg扩增。<br> 分离肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞与MACS分选的脾脏CD4+T细胞共培养,同时给予MHC-Ⅱ中和抗体预处理,发现肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞增加CD4+CD25+细胞比例的作用明显受到抑制;同时给予MHC-Ⅱ中和抗体抑制肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞对CD4+CD25+细胞Foxp3上调作用。表明炎症诱导肺腺癌组织中,AT-Ⅱ细胞可以依赖MHC-Ⅱ诱导CD4+CD25+Foxp3+Treg扩增。<br> 结论:<br> 1.TNF-α依赖性炎症反应介导肺腺癌组织中AT-Ⅱ细胞高表达MHC-Ⅱ与CD4+CD25+Treg浸润有关。<br> 2.TNF-α依赖性炎症反应上调肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞MHC-Ⅱ表达以及诱导Treg扩增。<br> 3.TNF-α依赖性炎症反应介导肺腺癌组织AT-Ⅱ细胞依赖MHC-Ⅱ诱导Treg扩增。
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