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摘要肺动脉高压（pulmonaryhypertension，PH）的重要临床特征是肺动脉（pulmonaryarteries，PAs）压力持续增高和重塑，主要由于肺动脉平滑肌细胞（pulmonaryarterialsmoothmusclecells,PASMCs）胞浆内不断升高的游离Ca2+浓度（intracellularfreecalciumconcentration,[Ca2+]i）导致的。研究表明，PASMCs的异常是肺动脉高压发生发展的重要病理学特征，其钙稳态的失衡以及增殖凋亡失衡是肺血管重塑的关键。<br>　　研究表明，严重PH患者的肺组织炎症与氧化应激(Oxidativestress)相关,在心血管系统中为活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)主要来源的NADPH氧化酶(NADPHoxidase,Nox)蛋白家族表达显著增加，并且瞬时受体电位(transientreceptorpotential,TRP)超家族中唯一一个氧化敏感型通道瞬时受体电位M型2（transientreceptorpotentialmelastatin2,TRPM2）的表达也显著上升。然而，Nox家族与TRPM2在肺动脉高压中的作用机制尚不明确。本研究在正常（control，CON）和慢性低氧性肺动脉高压（chronichypoxia-inducedpulmonaryhypertension,CHPH）大鼠中，首先检测PAs中Nox家族和TRPM2的表达，继而探讨Nox和TRPM2对5-HT及CH介导的PASMCs增殖迁移凋亡变化的影响，以及PH发展过程中Nox家族蛋白主要作用的亚型及其与TRPM2功能之间的关系，从而为PH发病机制的阐明及其靶向治疗提供新的科研依据。<br>　　第一部分CHPH大鼠中不同Nox亚型对大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响<br>　　目的：检测CHPH大鼠PAs中Nox家族基因表达的变化，观察不同Nox亚型对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响。<br>　　方法：清洁级雄性SD大鼠常压CH处理3周构建CHPH大鼠模型，在此基础上采用：①血流动力学检测方法检测大鼠右心室收缩压（rightventricularsystolicpressure,RVSP），分别计算两组模型中右心室重量指数（rightventricularmassindex,RVMI）的变化；②实时荧光定量PCR和Westernblot检测方法，测定大鼠去内皮PAs中Nox亚型mRNA和蛋白的表达水平；③MTS法和EdU掺入法，观察CHPH对PASMCs增殖的作用以及Nox抑制剂（Nox1抑制剂：ML171；Nox2抑制剂：gp91ds-tat；Nox4抑制剂：GKT137831）对5-HT及CH介导的PASMCs增殖水平的影响；④划痕愈合法和Transwell小室法，观察CHPH对PASMCs迁移的作用以及三种抑制剂对5-HT及CH对PASMCs迁移水平的影响；⑤AnnexinVFITC/PI试剂盒检测法，观察CHPH对PASMCs凋亡的作用以及三种抑制剂对5-HT及CH对PASMCs凋亡水平的影响⑥采用siRNA干扰技术特异性敲减Nox4基因，并观察敲减Nox4后对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响；<br>　　结果：与CON组大鼠相比，①RVSP从CON组的24.8±0.5mmHg升高到CH组的50.8±0.9mmHg，RVMI也从CON组26.3±0.5%升高到CHPH组36.5±1.4%，提示PH大鼠模型构建成功；②CHPH大鼠去内皮PAs中Nox1、2、4的mRNA表达显著升高，而蛋白表达以Nox1和Nox4升高为主，提示在PH的发展过程中参与的Nox亚型主要以Nox1和Nox4为主；③与CON组相比，CHPH大鼠中PASMCs细胞数目显著增高（OD值由CON组的0.79±0.01增加到CH组的1.34±0.09），且EdU的掺入率在CHPH大鼠PASMCs也显著增加，EdU掺入率由0.31±0.02增加到0.45±0.02，提示CHPH大鼠PASMCs中细胞增殖水平显著增强；CHPH大鼠中PASMCs24h划痕愈合面积显著增加，且Transwell小室中迁移到下室的细胞数目在CHPH大鼠PASMCs也显著增加，由CON组的71.8±4.34增加到CH组的146.91±5.05，提示CHPH大鼠PASMCs中细胞迁移水平显著增强；CHPH大鼠中PASMCsFITC标记的AnnexinV结合率显著减少，提示CHPH大鼠PASMCs中细胞凋亡水平显著抑制；④与CH引起的PASMCs增殖迁移增强，凋亡减少的作用相似，5-HT对CON组PASMCs也具有促进增殖迁移，抑制凋亡的作用，提示在CHPH过程中可能是通过5-HT的作用而产生的PASMCs增值迁移凋亡的改变。⑤在5-HT诱导的CON大鼠PASMCs和CHPH模型大鼠PASMCs中，ML171可抑制5-HT和CH引起的PASMCsOD值增加，以及5-HT引起的细胞增殖水平升高，但对CH引起的细胞增殖水平增加没有明显抑制作用。同时ML171可以明显抑制5-HT和CH引起的PASMCs细胞迁移。GKT137831对5-HT和CH引起的PASMCs增殖和迁移均有显著的抑制作用，但gp91ds-tat对5-HT和CH引起的PASMCs增殖和迁移均无显著的抑制作用。在细胞凋亡中，ML171、gp91ds-tat和GKT137831均可以进一步促进5-HT引起的细胞凋亡抵抗，而在CH组中，三种抑制剂均可以减少慢性低氧引起的细胞凋亡抵抗至正常水平。提示在三种Nox亚型中，对慢性低氧PASMCs增殖迁移凋亡的影响可能是以Nox4发挥主要作用；⑥特异性敲低Nox4基因均能抑制正常PASMCs的增殖迁移凋亡，与前述抑制剂的效果一致，提示Nox4对PASMCs的增殖迁移凋亡具有不可缺少的作用。<br>　　结论：CH预处理3周能够成功诱导大鼠发生PH和右心肥厚；其机制可能是CHPH大鼠Nox-ROS-TRPM2信号通路中由5-HT引起Nox1和Nox4的表达显著增加，以Nox4作用为主，引起ROS的来源增加，进一步引起增殖迁移和凋亡变化，促进PAs血管重塑，导致PH的发生发展。<br>　　第二部分CHPH中TRPM2对大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响<br>　　目的：观察Nox-ROS-TRPM2信号通路中TRPM2在CHPH组PAs的表达变化，以及TRPM2对5-HT诱导CON大鼠PASMCs和CHPH模型大鼠PASMCs增殖、迁移和凋亡水平的影响，进一步探讨Nox4和TRPM2在PASMCs增殖迁移上的共同作用，以明确在CHPH发病过程中Nox-ROS-TRPM2对细胞增殖迁移凋亡的调控作用。<br>　　方法：①实时荧光定量PCR和Westernblot检测方法，测定大鼠去内皮PAs中TRPM2的表达水平；②采用TRPM2抑制剂（2APB:100μM、ACA：30μM、PJ34：100μM）分别孵育24h，应用MTS法和EdU掺入法，划痕愈合法和Transwell小室法，AnnexinVFITC/PI试剂盒检测法，分别观察三种抑制剂对5-HT及CH诱导PASMCs增殖、迁移和凋亡的影响；③采用siRNA干扰技术特异性敲减TRPM2基因，并观察敲减TRPM2后对大鼠PASMCs增殖迁移凋亡的影响；④应用GKT137831分别和ACA、2APB、PJ34联合作用，观察同时抑制Nox4和TRPM2时，5-HT及CH诱导的大鼠PASMCs增殖迁移的变化。<br>　　结果：①与CON组相比，CH组TRPM2的mRNA和蛋白表达明显增加，提示TRPM2参与CHPH的发生发展；②2APB和PJ34可显著抑制5-HT和CH引起的PASMCs增殖迁移水平增强。ACA作用较弱。但同时三种抑制剂均可促进5-HT和CH引起的PASMCs细胞凋亡；提示TRPM2参与CHPH过程中PASMCs增值迁移凋亡的调控；③特异性敲低TRPM2基因均能抑制正常PASMCs的增殖迁移凋亡，提示TRPM2对PASMCs的增殖迁移凋亡具有不可缺少的作用。④GKT137831与ACA、2APB和PJ34分别联合用药，均可以不同程度度抑制5-HT以及CH引起的PASMCs增殖迁移，提示Nox4和TRPM2在CHPH过程中PASMCs引起的增殖迁移中起协同作用。<br>　　结论：在CHPH过程中TRPM2表达增强。抑制TRPM2通道均能够显著抑制PASMCs的增殖迁移,并促进凋亡，表明TRPM2参与CHPH发生发展过程中的PASMCs的增殖迁移凋亡调控，在与Nox4同时抑制时，5-HT以及CH引起的PASMCs增殖迁移也被抑制，提示Nox4与TRPM2具有协同作用，TRPM2可能作为Nox4的下游信号调控细胞的增殖迁移凋亡。<br>　　第三部分Nox4-ROS-TRPM2信号通路在CHPH发病中的作用<br>　　目的：观察Nox4基因敲除（Nox4-/-）对CHPH的影响以及Nox4-/-对5-HT介导的PASMCs增殖迁移凋亡的作用。观察Nox4基因敲除后TRPM2的变化。进一步明确在CHPH过程中Nox4和TRPM2通道的相互作用以及对PASMCs功能的调控。<br>　　方法：①利用琼脂糖电泳法、westernblot、PCR技术验证Nox4-/-小鼠敲除是否成功；②与野生型慢性低氧小鼠模型比较，观察Nox4-/-小鼠CH模型血流动力学和RVMI的变化。③利用MTS法、划痕愈合法和AnnexinVFITC/PI标记法观察Nox4-/-对5-HT诱导的PASMCs增殖迁移凋亡的影响。④Westernblot和PCR技术检测Nox4-/-小鼠中TRPM2的表达。<br>　　结果：①琼脂糖电泳法显示Nox4-/-小鼠的DNA条带在300bp左右，高于野生型小鼠的DNA条带228bp，提示Nox4-/-小鼠的基因型是纯合子Nox4-/-。Westernblo和PCR技术显示与野生型小鼠肺组织相比，Nox4-/-小鼠的Nox4mRNA和蛋白表达水平几乎没有，提示Nox4基因敲除成功，保证实验的准确性。②与野生型小鼠慢性低氧模型比较，Nox4-/-小鼠CH模型中肺动脉压力明显降低、RVMI也显著减小。提示Nox4基因的缺失可以降低CHPH过程中因CH引起的RVSP、RVMI升高，提示Nox4-/-有利于CHPH的预防。③与野生型小鼠的PASMCs比较，Nox4-/-可以有效抑制5-HT引起的PASMCs增殖和迁移，且进一步促进PASMCs凋亡，提示Nox4基因确实对CH过程中PASMCs增殖迁移凋亡有不可缺少的作用。④与野生型小鼠肺组织相比，Nox4-/-小鼠中TRPM2的mRNA和蛋白的表达水平增加，提示Nox4与TRPM2存在相互调节作用。<br>　　综上所述，PASMCs中氧化应激水平的增加导致Nox表达和功能活性的增强以及TRPM2功能的上调在CHPH致病过程中发挥了重要作用。CH通过5-HT上调Nox家族主要作用亚型Nox4的表达，通过产生过量的ROS激活TRPM2通道进而调控PASMCs[Ca2+]i变化，引起细胞增殖迁移凋亡水平的变化，导致血管重塑，促进PH的发生发展。此外，在Nox4-/-小鼠中CH所致血管重塑能够有效缓解，且5-HT诱导的细胞增殖迁移也显著降低，进一步表明Nox4在肺动脉高压发生发展中的氧化应激反应起重要作用。Nox4-/-小鼠中TRPM2表达增加，说明TRPM2依赖于Nox4而作用。以上结果为阐明PH的发病机制和PH的靶向治疗提供新的科研依据。