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摘要人多能干细胞及其终末分化的功能性细胞在药物筛选、疾病模型、细胞移植与临床治疗上具有广泛的应用，而这要求率先获取较高数量级、高质量的人多能干细胞（hPSCs）作为基础。目前，结合搅拌式生物反应器，以细胞聚集体和微载体形式的3D悬浮培养方法已成为规模化扩增hPSCs的重要手段。肝脏移植是急性肝衰病人的首选治疗方法，但由于供体肝的缺乏，肝细胞治疗以及生物人工肝治疗是目前延长急性肝衰病人生命的重要治疗手段。然而每次治疗至少需要1010数量级的肝细胞，这就使得临床上对肝细胞的需求更加迫切，而人多能干细胞定向诱导分化肝细胞有望能够解决这一问题。<br>　　目的：为解决生物制药和临床上对人多能干细胞及其终末分化的功能性细胞的大量需求这一问题，我们探索建立高效的3D悬浮培养扩增人多能干细胞的方法，以及建立人多能干细胞3D悬浮培养定向诱导分化肝细胞的路线，为获得高数量级且高质量的人多能干细胞和功能性良好的肝细胞奠定基础工作。<br>　　方法：1、以细胞聚集体或微载体形式在静态或动态3D悬浮培养条件下扩增人多能干细胞；2、分析细胞聚集体形态、细胞计数、细胞聚集体尺寸、细胞活力和细胞扩增倍数；3、通过实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、蛋白质免疫印迹（WB）、流式细胞检测（FACS）和聚集体的免疫荧光染色验证所建立的3D悬浮培养方法中收获的细胞能够维持多能性；4、通过拟胚体（EB）形成实验、拟胚体（EB）的免疫荧光染色分析和畸胎瘤形成实验验证所建立的3D悬浮培养方法中收获的细胞能够保持多向分化的潜能；5、通过转录组测序（mRNA-seq）和数据分析寻找化合物葡聚糖硫酸酯（DS）能够控制聚集体尺寸大小的机理以及化学高分子聚乙烯醇（PVA）能够促进细胞增殖的机理；6、使用水/油/水（W/O/W）双乳化技术制备多孔以及实心的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微载体；7、使用钨灯丝扫描电镜（SEM）对所制备出的多孔以及实心的PLGA微载体进行喷金扫描成像；8、使用RT-qPCR、FACS分析人多能干细胞定向诱导分化成内胚层细胞球、肝祖细胞球和肝细胞球的分化效率；9、使用免疫荧光染色、琼脂糖包埋切片和Hamp;E染色分析肝祖细胞球的结构以及功能；10、使用酶联免疫吸附法（ELISA）检测培养基上清中白蛋白（ALB）的分泌量，通过奥美拉唑、利福平等药物诱导药物代谢酶表达的实验分析肝细胞球对诱导物反应的能力。<br>　　结果：在本课题研究中，我们建立了一种基于添加化学成分的人多能干细胞体外3D悬浮扩增培养的方法，即联合使用化合物葡聚糖硫酸酯（DS）和化学高分子聚乙烯醇（PVA）提高人多能干细胞3D悬浮培养的产量以及扩增效率。我们发现DS和PVA的组合搭配使用不仅促进了人多能干细胞的增殖，而且还控制了细胞聚集体的尺寸大小，联合处理后的人多能干细胞仍然能够保持自我更新能力以及多向分化潜能。转录组测序结果表明，DS通过影响与细胞间粘附有关的基因和通路阻止细胞聚集从而控制细胞聚集体尺寸，而PVA通过改善细胞能量代谢相关过程，调节细胞生长、增殖和分裂，从而提高细胞扩增速率，两者联合处理后既能控制细胞聚集体尺寸以保证细胞质量与回收率，也能促进细胞增殖，最终提高体外悬浮培养的效率。总而言之，我们建立了一种简单且可靠的基于搅拌式生物反应器的3D悬浮规模化扩增培养人多能干细胞方法。此外，我们还制备了质量较优的实心和多孔PLGA微载体，后续将应用于人多能干细胞规模化扩增以及定向分化。最后，我们还建立了一条高效、低成本的在3D悬浮培养条件下人多能干细胞定向诱导分化肝细胞的方法，所分化的肝细胞球具有良好的白蛋白分泌水平和药物代谢能力。因此，本课题的研究结果将有助于解决生物制药和临床上对人多能干细胞及其终末分化的功能性肝细胞的紧迫需求。