检索历史 清除

摘要近一个世纪以来，流感病毒不断地发生变异，其传染性和致病性对全球公共卫生安全的威胁愈发严重。流感病毒属于正粘病毒科负链RNA病毒，其重要亚型A型流感病毒（InfluenzaAVirus,IAV）由于具有的高突变性和重组性，因而能够跨宿主传播和大规模流行，对人类的危害极高。目前人类对抗IAV的感染主要依赖于自身的免疫。因此，了解IAV的毒力因子及其感染后对抗宿主免疫的作用机制对于流感的防控及抗病毒药物的研制至关重要。<br>　　在2012年，研究人员发现IAV的第三个病毒片段PA基因中包含的重叠开放阅读框，不仅能编码PA蛋白，还可以编码一种新型融合蛋白PA-X，其N末端的191个氨基酸残基由PA开放阅读框编码，而C末端氨基酸残基由核糖体+1移码而产生的开放阅读框编码。目前的研究表明PA-X并不是IAV的结构蛋白，仅在IAV感染宿主细胞产生和发挥作用。目前研究表明PA-X具有核酸内切酶活性，能诱导宿主细胞关闭和调节宿主免疫应答；是与IAV致病性相关的重要蛋白。<br>　　IAV对宿主细胞的感染、复制、致病以及逃避宿主免疫都离不开它与宿主蛋白的各种相互作用。因此研究PA-X与宿主蛋白的相互作用，对于阐明其在IAV感染中发挥的生物学功能非常必要。我们通过串联亲和层析（TandemAffinityPurification，TAP）、酵母双杂交（YeastTwo-Hybridization,Y2H）等技术，筛选了宿主细胞中可能与PA-X蛋白相互作用的蛋白。研究结果发现锚蛋白Ankrd17可特异性结合PA-X蛋白，Ankrd17蛋白N端特有ankyrinrepeat结构是它与PA-X结合的关键区域。<br>　　天然（固有）免疫系统是机体抵御流感病毒感染的重要防线。RIG-I(Retinoicacidinduciblegene-Ⅰ)样受体（RIG-I-likereceptors，RLRs）负责识别细胞质中的外源RNA分子并激活天然免疫反应，是宿主抗IAV感染的重要模式识别受体。最近研究人员发现Ankrd17蛋白能与RIG-I结合并增强RLR介导的免疫反应，从而促进由IAV诱导的宿主RLR通路信号转导，导致宿主IFN-β表达上调，最终增强了天然免疫。在此过程中，Ankrd17中的ankyrinrepeat结构域是其与RIG-I的相互作用的关键区域，是其提高宿主免疫应答所必需的区域。<br>　　本文深入研究了PA-X蛋白能否通过与Ankrd17蛋白结合来影响其对免疫应答的调控。我们发现PA-X和Ankrd17结合可以显著抑制Ankrd17对流感病毒RNA介导的天然免疫信号转导的增强，最终下调了IFN-β表达。在进一步研究中，为了解PA-X基因抑制Ankrd17蛋白所增强的宿主RLR通路天然免疫的机制，我们基于A/PR/8/34（H1N1）病毒株，利用定点突变技术及反向遗传操作构建了PA-X缺失突变株（PR8-FS），对比了亲本毒株及突变毒株在体外细胞系中的免疫应答。结果显示缺失PA-X的病毒PR8-FS感染后293T后，与亲本毒株相比，Ankrd17对IFN-β的激活明显增强。同时，我们验证了在293T细胞内Ankrd17基因进行了敲除后宿主细胞的变化，对比正常细胞，敲除Ankrd17基因的细胞株在感染IAV后只产生微弱的免疫应答，其细胞内PA-X对天然免疫的抑制程度较正常细胞也显著减弱。这表明了PA-X可通过与Ankrd17之间的相互作用从而调节宿主先天免疫。故此，我们的研究结果显示PA-X可能通过其与Ankrd17结合来抑制宿主免疫，从而有利于病毒自身的复制。<br>　　综上所述，本研究首次鉴定了PA-X在宿主细胞内的互作蛋白Ankrd17；证明了PA-X通过与Ankrd17蛋白结合来抑制其对RLR信号通路的增强；并最终导致宿主IFN-β蛋白表达水平的下调，从而抑制宿主感染IAV后的免疫增强效应。这一作用一方面有利于流感病毒自我的复制，另一方面也降低了宿主感染IAV后导致的过度免疫对自身的损害。本研究从宿主蛋白与PA-X互作的角度解析了PA-X基因在调控IAV致病性及致病机制中的作用；证明了PA-X可能是IAV重要的致病因子；PA-X与Ankrd17的相互作用关系与生理学功能的阐释可以为抗IAV治疗和新药开发提供新靶标和新思路。